阿嗪米特中潛在基因毒性雜質馬來酰肼的含量測定

趙鈺馨 孫秉喆 倪衛星 梁然植 狄斌 蘇夢翔

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）18-2189-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.18.03

摘 要 目的：建立阿嗪米特原料藥中潛在基因毒性雜質馬來酰肼含量測定的方法。方法：采用高效液相色譜-熒光檢測器法。以Thermo Syncronis C18為色譜柱，以0.2 mol/L乙酸溶液-甲醇為流動相進行梯度洗脫;柱溫為30 ℃;激發波長為315 nm，發射波長為389 nm;流速為1 mL/min;進樣量為20 μL。結果：空白溶劑和阿嗪米特均不干擾馬來酰肼的測定;馬來酰肼檢測質量濃度的線性范圍為19.5～300 ng/mL（r=0.999 9）;檢測限為4.5 ng/mL，定量限為19.5 ng/mL;加樣回收率為98.79%～103.76%（RSD均小于3.00%，n=9）;精密度、穩定性（24 h）試驗的RSD均不大于5.63%，且耐用性試驗的RSD均小于2.00%（n=6）。3批阿嗪米特原料藥中均未檢出馬來酰肼。結論：該方法專屬性好、靈敏度高、定量準確，可用于阿嗪米特或其他基質中馬來酰肼的痕量測定。

關鍵詞 馬來酰肼;阿嗪米特原料藥;高效液相色譜-熒光檢測器法;基因毒性雜質

Content Determination of Potential Genotoxic Impurity Maleic Hydrazide in Azintamide

ZHAO Yuxin1，SUN Bingzhe1，2，NI Weixing2，LIANG Ranzhi2，DI Bin1，3，4，SU Mengxiang1，3，4[1. School of Pharmacy， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China; 2. Yangzhou Yiyang Pharmaceutical Co.， Ltd.， Jiangsu Yangzhou 225600， China; 3. Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance （China Pharmaceutical University）， Ministry of Education， Nanjing 210009， China; 4. Key Laboratory for Research and Evaluation of Pharmaceutical Preparations and Excipients， National Medical Products Administration， Nanjing 210009， China]

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for the content determination of potential genotoxic impurity maleic hydrazide in azintamide raw material. METHODS： HPLC-FLD method was adopted. The determination was performed on Thermo Syncronis C18 column with mobile phase consisted of 0.2 mol/L acetic acid-methanol （gradient elution）. The column temperature was set at 30 ℃， the excitation wavelength was 315 nm and emission wavelength was 389 nm. The flow rate was 1 mL/min， and the sample size was 20 μL. RESULTS： The blank solvent and azintamide did not interfere with the determination of maleic hydrazide. The linear range of maleic hydrazide was 19.5-300 ng/mL （r=0.999 9）. The limit of detection was 4.5 ng/mL and the limit of quantification was 19.5 ng/mL. The recovery ranged from 98.79% to 103.76% （RSDs were lower than 3.00%，n=9）. RSDs of precision and stability（24 h）tests were no more than 5.63%，and those of durability tests were less than 2.00% （n=6）. Maleic hydrazide was not detected in 3 batches of azinamide raw material. CONCLUSIONS： The method is specific， sensitive and accurate. It can be used for the trace determination of maleic hydrazide in azintamide or other matrix.

KEYWORDS? ?Maleic hydrazide; Azintamide; HPLC-FLD; Genotoxic impurity

馬來酰肼（maleic hydrazide）的化學名為順丁烯二酰肼，是一種合成噠嗪類化合物的常用原料。噠嗪類化合物作為重要的中間體，被廣泛應用于農藥及頭孢唑蘭、普納替尼等藥品的合成中[1-4]。盡管目前尚無證據證明馬來酰肼具有基因毒性和致癌性，但其結構中存在警示結構——肼，故該成分為潛在的基因毒性雜質[5]。潛在基因毒性雜質的毒性雖然未經實驗證實或模型驗證，但人用藥品注冊技術要求國際協調會、美國FDA及歐洲藥品管理局等均對其在藥品中的限度提出了具體要求[6-8]。

阿嗪米特（azintamide）的化學名為2-（6-氯噠嗪-3-基）硫烷基-N，N-二乙基乙酰胺，于1959年首次合成[9]，是一種促進膽汁分泌的藥物，可用于治療因膽汁分泌不足而引起的消化系統方面的疾病[10-11]。目前，阿嗪米特已成為臨床上主要使用的消化酶類藥物之一[11]，而馬來酰肼為其合成的起始物料[12]。因此有必要建立靈敏度高、專屬性強、基質干擾小、重復性好的痕量定量分析方法來對馬來酰肼在阿嗪米特原料藥中的殘留量進行考察。由于馬來酰肼沸點高、不易氣化，常用的檢測方法有高效液相色譜（HPLC）-紫外法（檢測限135 ng/mL）、液質聯用法（檢測限0.5 ng/mL）等[13-15]。其中，液質聯用技術的檢測限雖然可達0.5 ng/mL[15]，但易受大型儀器設備成本高和普及性低的限制。鑒于此，本研究利用馬來酰肼的熒光特性，采用選擇性好、靈敏度高的高效液相色譜-熒光檢測器法（HPLC-FLD）對阿嗪米特原料藥中潛在基因毒性雜質馬來酰肼進行定量分析，以期為其質量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

RF-6000型熒光分光光度計、LC-20AD型HPLC儀（包括RF-20A型FLD、LabSolutions 6.81網絡版工作站）均購自日本Shimadzu公司;BT25S型電子天平購自德國Sartorius公司;Synergy UV型超純水系統購自德國Merck公司;KH-250DB型數控超聲波清洗器購自昆山禾創超聲儀器有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

馬來酰肼和阿嗪米特的結構式見圖1。

馬來酰肼對照品（美國AccuStandard公司，批號02317JT，純度100%）;阿嗪米特原料藥（由揚州一洋制藥有限公司提供，由韓國東邦化學株式會社生產，批號分別為190011、190012、190013，純度均不低于99%）;乙酸（南京化學試劑股份有限公司）為分析純，甲醇（美國Tedia公司）為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以Thermo Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以0.2 mol/L乙酸溶液（A）-甲醇（B）為流動相進行梯度洗脫（0～3 min，90%A;3～4 min，90%A→10%A;4～12 min，10%A;12～13 min，10%A→90%A;13～18 min，90%A）;柱溫為30 ℃;激發波長為315 nm，發射波長為389 nm;流速為1 mL/min;進樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取馬來酰肼對照品約20 mg，精密稱定，置于20 mL量瓶中，加溶劑[0.2 mol/L乙酸溶液-甲醇（1 ∶ 1，V/V），下同]適量，超聲（頻率40 kHz，功率250 W，下同）處理30 min使溶解，然后加溶劑稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度為1 mg/mL的對照品貯備液。取上述對照品貯備液30 μL，置于10 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含馬來酰肼3 μg的對照品溶液。

2.2.2 限度對照品溶液 取“2.2.1”項下對照品溶液500 μL，置于10 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含馬來酰肼150 ng的限度對照品溶液。

2.2.3 含限度濃度雜質的供試品溶液 取阿嗪米特原料藥約500 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加溶劑適量，然后加入“2.2.1”項下對照品溶液500 μL，超聲處理30 min使溶解，然后加溶劑稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含馬來酰肼150 ng的含限度濃度雜質的供試品溶液。

2.2.4 供試品溶液 取阿嗪米特原料藥約500 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加溶劑適量，超聲處理30 min使溶解，然后加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 專屬性試驗

取空白溶液（溶劑）以及“2.2”項下限度對照品溶液、供試品溶液和含限度濃度雜質的供試品溶液各20 μL，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，馬來酰肼的保留時間在4.5 min左右，其色譜峰峰形良好，基線平穩;理論板數以馬來酰肼計大于6 000，馬來酰肼色譜峰與相鄰色譜峰間的分離度大于1.5，且空白溶液不干擾測定。專屬性試驗的HPLC圖見圖2。

2.4 線性關系考察

分別取“2.2.1”項下對照品溶液65、150、250、500、750、1 000 μL，置于不同10 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，制成馬來酰肼質量濃度分別為19.5、45、75、150、225、300 ng/mL的系列標準溶液。取上述系列標準溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標、待測物質量濃度（x，ng/mL）為橫坐標，采用最小二乘法進行線性回歸。結果顯示，馬來酰肼的線性方程為y=34.709x+10.472（r=0.999 9），該成分檢測質量濃度的線性范圍為19.5～300 ng/mL（相當于限度的13%～200%）。

2.5 檢測限和定量限考察

取“2.2.2”項下限度對照品溶液適量，用溶劑逐級稀釋，然后分別按“2.1”項下色譜條件平行測定6次。將測得的信號與空白處的信號（基線噪音）進行比較，分別以信噪比3 ∶ 1、10 ∶ 1計算檢測限和定量限。結果，馬來酰肼的檢測限為4.5 ng/mL、定量限為19.5 ng/mL，6次平行測定的定量限的RSD為4.03%（n=6），表明該方法靈敏、穩定。

2.6 精密度試驗

2.6.1 儀器精密度 取“2.2.3”項下含限度濃度雜質的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，雜質保留時間和峰面積的RSD分別為0.05%、0.74%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6.2 重復性 取阿嗪米特原料藥（批號190011）適量，按“2.2.3”項下方法制備含限度濃度雜質的供試品溶液，平行制備6份。分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算雜質的含量。結果顯示，雜質含量的RSD為2.69%（n=6），表明方法的重復性良好。

2.6.3 中間精密度 分別由2名實驗人員于不同時間點按“2.2.3”項下方法制備含限度濃度雜質的供試品溶液（批號190011），各平行制備6份。分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算雜質含量。結果顯示，2名實驗人員測得雜質含量的RSD為5.63%（n=12），表明方法的中間精密度良好。

2.7 準確度試驗

取阿嗪米特原料藥（批號190011）約500 mg，共9份，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，加溶劑適量，然后分別加入“2.2.1”項下對照品溶液250、500、750 μL，各3份，超聲處理30 min使溶解，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，分別作為質量濃度相當于雜質限度50%、100%和150%的供試品溶液。取上述溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算馬來酰肼的含量并計算其加樣回收率。結果顯示，各質量濃度供試品溶液中馬來酰肼的加樣回收率在98.79%～103.76%范圍內，RSD均小于3.00%（n=3），表明方法的準確度良好。準確度試驗結果見表1。

2.8 穩定性試驗

取“2.2.2”項下限度對照品溶液和“2.2.3”項下含限度濃度雜質的供試品溶液，分別于室溫下放置0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，限度對照品溶液和含限度濃度雜質的供試品溶液中馬來酰肼峰面積的RSD分別為1.55%和1.62%（n=14），表明上述溶液在室溫下放置24 h穩定。

2.9 耐用性試驗

按“2.2.3”項下方法制備含限度濃度雜質的供試品溶液（批號190011），在其他色譜條件不變的情況下，采用外標法分別考察流動相A不同濃度（0.196 7、0.200 0、0.203 3 mol/L）、不同流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）、不同柱溫（25、30、35 ℃）、不同檢測波長[激發波長、發射波長（313 nm、387 nm;315 nm、389 nm;317 nm、391 nm）]對含量測定結果的影響，并計算其回收率，每個條件平行測定2次，取平均值。結果顯示，各種條件下馬來酰肼回收率的RSD均小于2.00%（n=6），表明方法的耐用性良好。耐用性試驗結果見表2。

2.10 樣品中雜質含量測定

取3批阿嗪米特原料藥，分別按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算馬來酰肼含量。結果顯示，3批阿嗪米特原料藥中均未檢出馬來酰肼。阿嗪米特中馬來酰肼含量測定結果見表3。

3 討論

3.1 限度的確定

馬來酰肼作為3類致癌物質，尚無充足證據證實其致癌性，但其對非目標生物的慢性毒性仍存在不確定性[15]。由于馬來酰肼具有潛在的基因毒性，故本研究按基因毒性雜質分類中的2類物質使用毒理學關注閾值（TTC）對其進行限度控制[8]，以確保藥品的安全性[16-17]。根據TTC計算可接受攝入量發現，一個具有誘變性的雜質每天每人攝入1.5 μg時其風險被認為是可以忽略的（終生暴露情況下，理論的患癌風險小于十萬分之一）[18]?；蚨拘噪s質可接受限度（ppm）=TTC限度（μg/d）/藥物的最大日劑量（g/d）[6]。根據阿嗪米特說明書中每天最大劑量450 mg，可計算出馬來酰肼的可接受限度（ppm）=1.5（μg/d）/0.45（g/d）=3.33 ppm。因此，筆者將馬來酰肼的限度定為3 ppm。本研究所建立方法的檢測限可達0.09 ppm（4.5 ng/mL），遠低于上述限度。通過本研究建立的方法對3批阿嗪米特原料藥進行測定，結果均未檢出馬來酰肼，表明3批原料中馬來酰肼的含量均低于檢測限，滿足限度控制的要求。

3.2 檢測方法的選擇

筆者前期試驗發現，采用HPLC-紫外法進行測定的靈敏度不能滿足檢測要求。因本品含有共軛結構，具有熒光響應，考慮FLD的專屬性和靈敏度均優于紫外檢測器，所以筆者最終采用了HPLC-FLD法進行檢測。馬來酰肼是弱酸，在不同pH條件下其電離平衡會發生改變，熒光強度也會因其離解狀態不同而發生改變[19]。筆者在預試驗中發現，當流動相為0.1 mol/L乙酸溶液和甲醇時，馬來酰肼的響應信號較弱，無法滿足測定需要;當降低流動相pH后，馬來酰肼的響應信號明顯增強，故本研究最終確定流動相為0.2 mol/L乙酸溶液和甲醇。此外，筆者還通過固定激發波長對馬來酰肼對照品溶液進行發射波長掃描以及固定發射波長進行激發波長掃描，反復調整優化后確定激發波長為315 nm、發射波長為389 nm。本研究建立的HPLC-FLD法與Kubilius等[14]建立的方法（檢測限25 ng/mL）相比，檢測限更低（可達4.5 ng/mL）、峰形更理想。

綜上所述，本研究以阿嗪米特原料藥為檢測樣品，成功建立了測定馬來酰肼含量的HPLC-FLD法。方法學考察結果表明，該方法專屬性好、靈敏度高、定量準確，可為阿嗪米特或其他藥品中馬來酰肼的痕量測定提供參考。但此方法中流動相的水相為0.2 mol/L乙酸溶液，酸性較強，對色譜柱有一定損傷。此外，本研究僅檢驗了3批阿嗪米特原料藥，樣本量較少，有待進一步擴大樣本量加以研究。

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（收稿日期：2021-05-01 修回日期：2021-07-21）

（編輯：林 靜）