風熱清口服液對免疫低下小鼠免疫調節作用的研究

歐凱西 劉捷 張緣 周子意 趙玉民 余成浩

摘要 目的：探究風熱清口服液對免疫低下小鼠免疫調節的作用。方法：通過給小鼠腹腔注射免疫抑制劑環磷酰胺50 mg/kg，1次/d，連續3 d，建立免疫功能低下的動物模型。應用碳廓清實驗、溶血素生成實驗和遲發型變態反應，評價風熱清口服液對免疫低下小鼠非特異性免疫、體液免疫和細胞免疫的調節作用。結果：風熱清口服液低、中劑量組可不同程度提高環磷酰胺致免疫低下小鼠的廓清指數K值（P<0.05）和吞噬指數α值（P<0.05）。風熱清口服液低、中、高劑量組可不同程度提高免疫低下小鼠血清溶血素水平（P<0.05）。風熱清口服液低、中劑量組可不同程度促進免疫低下小鼠遲發型變態反應（P<0.05）。風熱清口服液低劑量組可提高免疫低下小鼠脾臟中CD4+細胞數（P<0.01），并使CD4+/CD8+細胞比值上升（P<0.001），同時抑制免疫低下小鼠脾臟中CD8+細胞數（P<0.05）;風熱清口服液中、高劑量組可提高免疫低下小鼠脾臟中CD4+/CD8+細胞比值（P<0.01），同時抑制免疫低下小鼠脾臟中CD8+細胞數（P<0.05）。風熱清口服液低、中劑量組可顯著提高免疫低下小鼠脾指數（P<0.001），風熱清口服液低、中、高劑量組均可提高免疫低下小鼠胸腺指數（P<0.05或P<0.01）。結論：風熱清口服液通過提高免疫低下小鼠非特異性免疫、體液免疫和細胞免疫，進而增強免疫低下小鼠的免疫功能。

關鍵詞 風熱清口服液;非特異性免疫;體液免疫;細胞免疫;免疫調節;免疫低下小鼠

Study on Immunomodulatory Property of Fengreqing Oral Liquid on Immunosuppressive Mice

OU Kaixi1，2，LIU Jie1，2，ZHANG Yuan1，2，ZHOU Ziyi1，2，ZHAO Yumin1，2，YU Chenghao1，2

（1 Basic Medical College，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu，611137，China; 2 State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources，Chengdu 611137，China）

Abstract Objective：To study the immunomodulatory activity of Fengreqing Oral Liquid on immuno-suppressive mice.Methods：Through intraperitoneal injection of 50 mg/kg immunosuppressant cyclophosphamide into mice，once a day for 3 consecutive days，an animal model of immunocompromised function was established.Carbon clearance test，quantitative hemolysis test and DNFB induced delayed-type hypersensitivity（DTH） were applied to assay the regulating effects of Fengreqing Oral Liquid on nonspecific immunity，humoral immunity and cellular immunity in immunocompromised mice.Results：The clearance index K（P<0.05） and values of phagocytic index α（P<0.05） of cyclophosphamide-induced immunocompromised mice could be elevated to varying degrees by Fengreqing Oral Liquid low and medium dose group.Productions of HClgM in serum were enhanced in different extent in immunosuppressive mice by Fengreqing Oral Liquid low，medium and high dose groups（P<0.05）.Fengreqing Oral Liquid low and medium dose group variously increased DTH reactivity in immunosuppressive mice（P<0.05）.Fengreqing Oral Liquid low dose group can not only increased percentages of T cells expressing CD4+（P<0.01） in the spleen of immunocompromised mice，but also enhanced the ratio of CD4+/CD8+ cells（P<0.001）.And Fengreqing Oral Liquid low dose group suppressed percentages of T cells expressing CD8+（P<0.05） in the spleen of immunocompromised mice.Fengreqing Oral Liquid medium and high dose group enhanced the ratio of the two subset of T lymphocyte（P<0.01），while suppressed percentages of T cells expressing CD8+（P<0.05）.Fengreqing Oral Liquid low and medium dose group obviously increased spleen index in immunosuppressive mice（P<0.001）.Fengreqing Oral Liquid low，medium and high dose group all increased thymus index in immunosuppressive mice（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：Fengreqing Oral Liquid enhances the immune function of immunocompromised mice by improving non-specific immunity，humoral immunity and cellular immunity of immunocompromised mice.

Keywords Fengreqing Oral Liquid; Nonspecific immunity; Humoral immunity; Cellular immunity; Immunoregulation; Immunosuppressive mice

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.013

風熱清口服液由“桔梗湯”和“青黛飲”兩方加上熊膽粉構成[1]，方中含金銀花、青黛、熊膽粉、瓜蔞皮、桔梗、甘草，用來治療外感風熱所致的發熱、微惡風寒、頭痛、咳嗽、流涕、口渴、咽痛，以及急性上呼吸道感染見上述癥狀者。前期研究發現，風熱清口服液有抗炎鎮痛等作用，而炎癥與免疫有著密不可分的聯系。因此，本實驗用環磷酰胺建立免疫力低下小鼠模型，并通過碳廓清實驗、溶血素生成實驗和遲發型變態反應（Delayed Type Hypersensitivity，DTH），進一步探究風熱清口服液對免疫功能低下小鼠的免疫調節作用，為風熱清口服液臨床運用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級昆明種小鼠168只，雌雄各半，體質量18～22 g，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010，飼養于成都中醫藥大學動物中心，溫度維持在20～25 ℃，濕度維持在40%～70%。本實驗已通過成都中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查（倫理學批號2020-13）。

1.1.2 藥物 風熱清口服液（四川省新鹿藥業有限公司，生產批號：Z10950074）;左旋咪唑（廣東華南藥業集團有限公司，生產批號：200601）;環磷酰胺（Baxter Oncology GmbH公司，德國，生產批號：0C372A）。

1.1.3 試劑與儀器 印度墨汁（大連美侖生物有限公司，批號：D1223A）;綿羊紅細胞（Sheep Red Blood Cells，SRBC，平睿生物科技有限公司，批號：20201117）;豚鼠血清（源葉生物科技有限公司，批號：H19N11Q131643）;碳酸鈉（天津市致遠化學試劑有限公司，批號：2020050195）;2，4-二硝基氟苯（1-fluoro-2，4-dinitrobenzene，DNFB，上海麥克林生化科技有限公司，批號：C11446846）;單克隆抗體PE-CD8a（Invitrogen公司，美國，批號：25-0081-82）;單克隆抗體FITC-CD4（Invitrogen公司，美國，批號：11-0041-82）;單克隆抗體APC-CD3（Invitrogen公司，美國，批號：17-0032-82）;電子天平（上海越平科學儀器制造有限公司，型號：FA2004B）;酶標儀（BioTek公司，美國，型號：CYT5MFV）;低溫離心機（四川蜀科儀器有限公司，型號：TGL-17）;流式細胞儀（Backman公司，美國，型號：CytoFLEX）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 環磷酰胺誘導免疫低下小鼠碳廓清實驗? 選取昆明小鼠48只，雌雄各半。隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、風熱清口服液高劑量組、風熱清口服液中劑量組、風熱清口服液低劑量組，每組8只。第3、4、5天除空白對照組小鼠外，均腹腔注射50 mg/kg環磷酰胺生理鹽水溶液，注射容積為10 mL/kg，建立免疫力低下模型[2-3]，并觀察小鼠狀態。

1.2.1.2 環磷酰胺誘導免疫低下小鼠血清溶血素生成的測定 取昆明小鼠60只，雌雄各半。隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、風熱清口服液高劑量組、風熱清口服液中劑量組、風熱清口服液低劑量組，每組10只。第3天每只小鼠腹腔注射10%的SRBC 0.2 mL致敏，第3、4、5天除空白對照組小鼠外每只小鼠腹腔注射環磷酰胺50 mg/kg，制備免疫低下模型[2]，并觀察小鼠狀態。

1.2.1.3 DNFB誘導免疫低下小鼠DTH 取昆明小鼠60只，雌雄各半。隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、風熱清口服液高劑量組、風熱清口服液中劑量組、風熱清口服液低劑量組，每組10只。第2天，每只小鼠腹部用8%硫化鈉脫毛，面積3 cm×3 cm。第3天，于脫毛部位皮膚均勻涂抹1%的DNFB丙酮麻油溶液50 μL，第6天同劑量強化1次。除空白對照組外，其余小鼠均在第5、6、7天腹腔注射環磷酰胺50 mg/kg，制備免疫低下模型。第9天，將1%DNFB丙酮麻油溶液20 μL均勻涂抹于小鼠右耳正反兩面[2-4]。

1.2.2 給藥方法

1.2.2.1 環磷酰胺誘導免疫低下小鼠碳廓清實驗? 陽性對照組灌胃左旋咪唑藥液（0.030 0 g/kg），風熱清口服液高、中、低劑量組，分別灌胃風熱清口服液20.050 0、10.025 0、5.012 5 g/kg濃度藥液，空白對照組和模型組灌胃蒸餾水，給藥體積10 mL/kg，1次/d，連續9 d。

1.2.2.2 環磷酰胺誘導免疫低下小鼠血清溶血素生成的測定 陽性對照組灌胃左旋咪唑藥液（0.030 0 g/kg），風熱清口服液高、中、低劑量組，分別灌胃風熱清口服液20.050 0、10.025 0、5.012 5 g/kg濃度藥液，空白對照組和模型組灌胃蒸餾水，給藥體積10 mL/kg，1次/d，連續9 d。

1.2.2.3 DNFB誘導免疫低下小鼠DTH 陽性對照組灌胃左旋咪唑藥液（0.030 0 g/kg），風熱清口服液高、中、低劑量組，分別灌胃風熱清口服液20.050 0、10.025 0、5.012 5 g/kg濃度藥液，空白對照組和模型組灌胃蒸餾水，給藥體積10 mL/kg，1次/d，連續10 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 環磷酰胺誘導免疫低下小鼠碳廓清實驗? 末次給藥1 h后，每只小鼠右眼內眥靜脈叢注射20%的印度墨汁生理鹽水溶液（10 mL/kg），2 min和10 min后分別從眼球取血40 μL并將其加到4 mL 0.1% Na2CO3溶液中，以正常小鼠血40 μL加到4 mL 0.1% Na2CO3溶液中做對照孔，600 nm波長測定吸光度OD值。取血后將小鼠頸椎脫臼處死，取動物肝、脾并稱重，以下列公式計算廓清指數K值和吞噬系數α值：K=（logA1-logA2）/（t2-t1）;α=3關節壓痛數×體質量/（肝質量+脾質量），其中A1、A2分別表示2 min、10 min時吸光度值，t1表示2 min，t2表示10 min。

1.2.3.2 環磷酰胺誘導免疫低下小鼠血清溶血素生成的測定 第9天給藥1 h后摘除眼球取血，將小鼠血離心后收集的血清作800倍稀釋后，吸取0.5 mL稀釋的血清放入另一試管中，并依次加入10% SRBC、10%豚鼠血清、生理鹽水各0.5 mL，空白調零管用生理鹽水代替血清，置37 ℃溫箱溫育30 min，冰浴10 min終止反應，1 000×g離心5 min，取上清液，用分光光度計在波長540 nm測OD值。計算溶血素水平（Hemolysin Concentration，HC）=樣本稀釋血清的OD值×稀釋倍數。

1.2.3.3 DNFB誘導免疫低下小鼠DTH 小鼠右耳涂抹1%的DNFB丙酮麻油溶液24 h后將小鼠稱重，隨后脫臼處死小鼠，剪下左右耳郭，用打孔器取下直徑8 mm的耳片并稱重，耳郭腫脹度=右耳片重-左耳片重，同時摘取小鼠脾臟和胸腺，剔除旁邊的筋膜和組織后稱取濕質量，計算每只小鼠的免疫器官指數，計算公式：免疫器官指數=臟器質量（mg）/體質量（g）。將取出的脾臟稱重后，迅速用機械法將小鼠脾臟組織處理成單細胞懸液，經300目濾布過濾后，加入PBS液將細胞濃度調整為106個/mL。取100 μL細胞懸液于流式管中，加入APC-CD3、FITC-CD4和PE-CD8a抗體各1 μg，混勻后4 ℃避光染色30 min。加入2 mL 4 ℃的PBS液，混勻，300×g離心5 min后棄上清液，加入400 μL的PBS液，立即流式細胞儀上機檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，滿足方差齊性檢驗者用LSD檢驗，不滿足方差齊性檢驗者，轉換數據后用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 風熱清口服液對免疫低下小鼠碳粒廓清的影響 用環磷酰胺建立小鼠免疫力低下模型后，觀察發現小鼠的進食量減少、體質量減輕、活動減少、易驚、掉毛、毛發光澤度降低。與模型組比較，風熱清口服液低、中劑量組均能提高小鼠廓清指數K值（P<0.05），同時提高小鼠吞噬指數α（P<0.05）。見表1。

2.2 風熱清口服液對免疫低下小鼠血清中溶血素含量的影響 小鼠血清中溶血素水平，模型對照組與空白對照組比較差異有統計學意義（P<0.001），風熱清口服液低、中、高劑量組和模型對照組比較差異均有統計學意義（均P<0.05），風熱清口服液能提高免疫低下小鼠血清中的溶血素水平。見表2。

2.3 風熱清口服液對免疫低下小鼠DTH的影響?? 小鼠耳組織涂抹1%DNFB溶液24 h后，空白對照組小鼠與模型對照組小鼠耳腫脹度差異有統計學意義（P<0.001）。風熱清口服液低劑量組與模型對照組小鼠耳腫脹度差異有統計學意義（P<0.01），風熱清口服液中劑量組與模型對照組小鼠耳腫脹度差異有統計學意義（P<0.05）。風熱清口服液低、中劑量組與模型組小鼠脾指數差異有統計學意義（P<0.001）。風熱清口服液低、高劑量組與模型組小鼠胸腺指數差異有統計學意義（P<0.01），風熱清口服液中劑量組與模型組小鼠胸腺指數差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 風熱清口服液對免疫低下DTH小鼠T淋巴細胞亞群的影響 風熱清口服液低劑量組與模型組小鼠脾臟中T淋巴細胞CD4+比較差異有統計學意義（P<0.01），風熱清口服液低、中、高劑量組與模型組小鼠脾臟中T淋巴細胞CD8+比較均差異有統計學意義（P<0.05），風熱清口服液低、中、高劑量組與模型組小鼠脾臟中T淋巴細胞CD4+/CD8+比值比較差異有統計學意義（P<0.01或P<0.001）。見表4，圖1～2。

3 討論

在機體的免疫系統中非特異性免疫是其關鍵組成部分，單核巨噬細胞的吞噬能力是衡量非特異性免疫功能的常用指標[5]。巨噬細胞是一種重要的免疫細胞，也是單核巨噬細胞系統的主要組成部分，在免疫應答和宿主防御中起著關鍵作用，其通過吞噬作用介導非特異性免疫反應，可通過細胞毒活性直接清除腫瘤、外部病毒、細菌甚至癌細胞[6]。同時，巨噬細胞受到刺激后能促進吞噬活性、調節各種細胞因子的分泌等[7]。小鼠碳廓清實驗是反映非特異性免疫的經典實驗方法，小鼠碳廓清實驗中所測得的廓清指數K可反映網狀內皮系統的吞噬功能，吞噬指數α則反映單核-巨噬細胞的吞噬能力[8-9]。實驗結果說明，風熱清口服液低、中劑量組能夠提升環磷酰胺所致免疫低下小鼠廓清指數K及吞噬指數α，從而提示風熱清口服液可以提高免疫低下小鼠巨噬細胞的吞噬功能，促進免疫低下小鼠的非特異性免疫功能。

SRBC致敏后小鼠血清溶血素水平的測定可作為體液免疫功能的評價指標[10]。淋巴細胞與SRBC抗原接觸產生的一種特異性抗體血清溶血素，可使紅細胞溶解，血清溶血素水平反映了淋巴細胞的增殖和分化水平，以及與體內特異性抗原SRBC接觸后，淋巴細胞特異性抗體分泌到血液中的情況[11-12]。實驗結果表明，風熱清口服液低、中、高劑量組均能夠提高環磷酰胺所致免疫低下小鼠血清溶血素水平，提示風熱清口服液可以促進免疫低下小鼠的體液免疫功能。

DTH是由T細胞介導的免疫應答的一種類型，T淋巴細胞介導的DTH的強弱，是反映機體細胞免疫功能的敏感指標之一[13]。T淋巴細胞包括T輔助/誘導性T細胞（CD4+）和T抑制/細胞毒性T細胞（CD8+），是細胞免疫的重要效應細胞[14]。CD4+和CD8+T淋巴細胞的表達，可提示細胞免疫功能狀態[15-16]，當CD4+T淋巴細胞減少時，提示機體免疫功能下降，而CD8+可抑制B細胞CD4+功能，妨礙機體形成抗體，抑制產生細胞免疫應答，因此CD8+水平越高，免疫抑制越強;CD4+/CD8+比值則是反映機體T細胞免疫功能的重要指標之一，其比值越低，提示機體免疫功能越弱[17]。實驗結果說明，風熱清口服液低、中劑量組可增強環磷酰胺所致免疫低下小鼠耳腫脹度。并且風熱清口服液低劑量組可顯著提高免疫低下小鼠脾臟中T淋巴細胞CD4+和CD4+/CD8+比值，降低免疫低下小鼠脾臟中T淋巴細胞CD8+的水平，風熱清口服中、高劑量組可顯著提高免疫低下小鼠脾臟中T淋巴細胞CD4+/CD8+比值，降低免疫低下小鼠脾臟中T淋巴細胞CD8+的水平，提示風熱清口服液可增強免疫低下小鼠的細胞免疫功能。

胸腺是中央免疫器官，是T淋巴細胞發育、分化和成熟的場所，脾臟是外周免疫器官，是成熟T、B淋巴細胞參與免疫應答的部位[18-19]，在免疫激活過程中，免疫細胞的分化和增殖導致其體質量增加，胸腺指數和脾指數反映胸腺和脾的質量[20]。因此，胸腺和脾臟質量與免疫十分密切。胸腺指數和脾指數的降低意味著免疫細胞數量的減少和免疫功能的下降。實驗結果表明，風熱清口服液低、中劑量組可明顯改善環磷酰胺所致免疫低下小鼠的脾指數，風熱清口服液低、中、高劑量組均可改善環磷酰胺所致免疫低下小鼠的胸腺指數，從而增強免疫低下小鼠的免疫功能。

綜上所述，風熱清口服液可通過促進環磷酰胺所致免疫低下小鼠非特異性免疫、體液免疫及細胞免疫功能，以及對免疫器官脾臟和胸腺的保護，起到增強免疫低下小鼠的免疫功能的作用，但其具體機制尚不明確，待進一步研究驗證。

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（2021-05-18收稿 責任編輯：王明）