TLR3活化對人脂肪間充質干細胞成骨分化的影響

金兵男 江鑫銘 李霄霞 趙春華

[摘要]?目的?探討Poly（I：C）活化人脂肪間充質干細胞（hAMSCs）Toll樣受體3（TLR3）后對hAMSCs成骨分化的影響。方法?膠原酶消化法分離提取hAMSCs，對其細胞形態、免疫學表型和成骨分化能力進行鑒定。將原代分離培養的hAMSCs隨機分為對照組和TLR3組，對照組不做處理，TLR3組用含有20 mg/L Poly（I：C）的正常培養基處理6 h活化TLR3。CCK8法檢測兩組hAMSCs增殖能力變化，Real-time PCR方法檢測hAMSCs成骨標志基因runt相關轉錄因子2（RUNX2）和骨鈣素（OCN）mRNA表達，Western Blot方法檢測RUNX2和OCN蛋白及NF-κB通路相關蛋白p-P65、P65表達。對照組和TLR3組均用間充質干細胞成骨誘導培養基誘導分化，12 d后用茜素紅染色法檢測兩組hAMSCs成骨誘導后鈣質沉積情況。結果?對照組和TLR3組hAMSCs的增殖能力差異無顯著性（P>0.05）。TLR3組hAMSCs成骨標志基因RUNX2及OCN的mRNA和蛋白表達均高于對照組（t=2.98～36.36，P<0.05），NF-κB通路相關蛋白P65及p-P65表達也高于對照組（t=3.52、13.85，P<0.05）。茜素紅染色結果顯示，成骨誘導12 d后TLR3組鈣質沉積程度高于對照組。結論?TLR3活化能夠通過激活NF-κB通路促進hAMSCs成骨分化。

[關鍵詞]?間質干細胞;脂肪組織;Toll樣受體3;成骨分化

[中圖分類號]?R329.21

[文獻標志碼]?A

[文章編號]?2096-5532（2021）04-0475-06

間充質干細胞（MSCs）是目前國內外研究最多的一類成體干細胞[1-4]，其來源廣泛，在脂肪、骨髓、臍帶、胎盤等多種成體組織中均廣泛存在[5]。其中，人脂肪來源MSCs（hAMSCs）已成為再生醫學領域中的理想種子細胞[6-10]。然而，在應用MSCs移植治療骨質疏松等疾病的過程中常有炎癥或細菌感染等情況發生，嚴重影響了MSCs移植的存活率和治療效果。因此，尋找MSCs預處理方式，提高MSCs移植存活率，增強體內治療效果，對MSCs的臨床應用具有重要意義[11-13]。Toll樣受體（TLRs）作為一類在固有免疫和適應性免疫中具有重要作用的模式識別受體，能夠識別大量病原相關分子，介導機體免疫反應，維持機體的平衡狀態，MSCs中也有部分表達TLRs[14]。已有研究顯示，表達TLR3的MSCs在TLR3被Poly（I：C）活化后表現出抗炎作用，TLRs活化能夠對MSCs的成骨分化產生影響[15]。使用Poly（I：C）活化MSCs的TLR3可以作為一種重要的MSCs預處理方法。本研究探討TLR3活化對hAMSCs增殖及成骨分化的影響，為hAMSCs在骨質疏松等疾病治療中應用提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?細胞和試劑

實驗所用hAMSCs為吸脂術病人廢棄的脂肪組織原代分離擴增獲得; DMEM高糖、DME/F12培養基購于美國Hyclone公司;胎牛血清購于Excell公司;青霉素和鏈霉素購于新賽美公司;膠原酶P購于美國Roche公司;堿性磷酸酶試劑盒、CCK8試劑盒、反轉錄試劑盒、SYBR Green Master Mix購于上海翊圣公司;Poly（I：C）、油紅O、茜素紅購于美國Sigma公司;SDS-PAGE凝膠試劑盒、磷酸酶抑制劑購于上海雅酶公司;D-hanks液、PBS、組織裂解液購于北京索萊寶公司;小鼠抗人FITC-CD14、FITC-CD34、FITC-CD45、PE-CD73、FITC-CD90、PE-CD105、FITC-HLA-DR購于美國BD公司。

1.2?hAMSCs的分離培養

取成人吸脂術采集的脂肪組織，D-hanks液清洗去除血細胞和麻醉藥物。加入適量2 g/L膠原酶P，37 ℃恒溫搖床消化30 min，100目篩網濾去未消化組織。加入足量D-hanks液，1 500 r/min離心10 min，棄上清，重復2次。重懸細胞沉淀，接種于hAMSCs培養基中，于含CO2培養箱內37 ℃恒溫培養，每3 d換液1次。當細胞生長達到80%融合時，進行傳代培養。

1.3?流式細胞術檢測免疫學表型

胰蛋白酶消化收集細胞，PBS清洗、重懸，加入相應直標抗體4 ℃孵育30 min，PBS清洗2次，重懸，流式細胞儀上檢測MSCs免疫學表型。

1.4?實驗分組及細胞增殖檢測

取第6代hAMSCs以每孔1×104的密度接種于96孔板中，隨機分為兩組，對照組不作處理，TLR3組加入20 mg/L Poly（I：C）工作液處理6 h活化TLR3。分別在活化后的0、24和48 h時每孔加入 CCK8工作液10 μL，37 ℃孵育90 min，酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度（A）值，以其表示hAMSCs增殖能力。

1.5?hAMSCs體外成骨誘導分化及鑒定

取第6代hAMSCs以5×103/cm2的密度接種于24孔板中，待其生長至80%融合時加入成骨誘導培養基（含體積分數0.10?FBS、 2×10-4mol/L抗壞血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的DMEM高糖培養基）誘導成骨分化，3 d更換1次新鮮成骨誘導培養基。①堿性磷酸酶染色：成骨誘導3 d后，PBS沖洗2次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，加入堿性磷酸酶染色工作液，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，光鏡下觀察對照組和TLR3組hAMSCs堿性磷酸酶活性變化情況。②茜素紅染色：成骨誘導12 d后，PBS沖洗2次，用40 g/L多聚甲醛室溫固定10 min，1 g/L茜素紅染色工作液室溫染色30 min;PBS沖洗3次后，在光鏡下觀察對照組和TLR3組hAMSCs鈣質沉積情況。

1.6?hAMSCs體外成脂誘導分化及鑒定

取第6代hAMSCs，以5×103/cm2的密度接種于24孔板中，待其生長至90%融合時加入成脂誘導培養基（DMEM高糖培養基中含有體積分數0.10 FBS、1×10-6mol/L地塞米松、50 mg/L抗壞血酸和100 mg/L IBMX）誘導成脂分化，每3 d更換1次新鮮成脂誘導培養基。成脂誘導12 d后，PBS沖洗2次，40 g/L多聚甲醛室溫固定10 min，油紅O染色工作液室溫染色30 min;PBS沖洗3次，光鏡下觀察hAMSCs脂滴形成情況。

1.7?Real-time PCR檢測成骨標志基因runt相關轉錄因子2（RUNX2）和骨鈣素（OCN）mRNA表達

取第6代hAMSCs以5×103/cm2的密度接種于6孔板中，隨機分為TLR3組和對照組，對照組不做處理，TLR3組用含有20 mg/L Poly（I：C）的正常培養基處理6 h，按照總RNA提取試劑說明書提取兩組樣本的細胞總RNA，應用反轉錄試劑盒進行反轉錄，反應條件：25 ℃、5 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。按照熒光定量試劑盒配制反應體系，反應條件：預變性95 ℃、30 s，變性95 ℃、10 s，退火/延伸60 ℃、30 s，共40個循環。以GAPDH為內參基因，2-ΔΔCt法計算hAMSCs成骨標志基因RUNX2和OCN mRNA表達情況。所用基因引物序列見表1。每個樣本設置3個復孔，實驗重復3次。

1.8?Western Blot方法檢測相關蛋白表達

細胞按1.7方法分組及處理后，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，蛋白樣品應用SDS-PAGE進行電泳分離，然后轉蛋白至硝酸纖維素膜上;50 g/L BSA室溫封閉90 min，添加一抗（β-actin、GAPDH、RUNX2、OCN、P65、p-P65，1∶1 000稀釋）4 ℃孵育過夜，添加羊抗兔二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育60 min，?使用超敏ECL發光液顯影，Image J軟件分析條帶灰度值，以GAPDH或β-actin作為對照，計算目的蛋白RUNX2、OCN、P65和p-P65相對表達量。實驗重復3次。

1.9?統計學分析

應用Graph Pad Prism 5軟件進行統計學分析。計量資料數據以x2±s表示，兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為有統計學意義。

2?結?果

2.1?hAMSCs形態、免疫學表型及成脂成骨分化能力鑒定

在光鏡下觀察，原代分離培養后的hAMSCs呈長梭形，旋渦狀分布，貼壁生長（圖1A）;堿性磷酸酶染色后細胞可見藍色沉淀，表明hAMSCs開始向成骨細胞分化（圖1B）;茜素紅染色細胞可見染成紅色的鈣質沉淀，表明hAMSCs成骨誘導12 d后分化為成骨細胞，分泌了大量鈣質沉積（圖1C）;油紅O染色后細胞中可見紅色脂滴，表明hAMSCs成脂誘導12 d后分化為脂肪細胞（圖1D）。流式細胞術檢測hAMSCs的免疫學表型結果顯示，CD14陽性率為0.9%，CD34陽性率0.4%，CD45陽性率0.5%，HLA-DR陽性率0.8%，均<5%;CD73陽性率為98.7%，CD90陽性率98.5%，CD105陽性率95.4%，FLK-1陽性率96.0%，均>95%。符合國際細胞學會對于MSCs的定義（圖1E）。證明從人脂肪組織中原代分離的細胞為hAMSCs。

2.2?各組hAMSCs增殖能力比較

CCK8法檢測結果顯示，對照組與TLR3組比較，hAMSCs活化后0、24和48 h時增殖能力差異無顯著性（P>0.05）。見表2。

2.3?各組RUNX2和OCN mRNA及蛋白表達的比較

Real-time PCR檢測顯示，TLR3組RUNX2和OCN的mRNA表達水平均較對照組顯著增加（t=14.39、36.36，P<0.01）。Western Blot檢測顯示，TLR3組RUNX2和OCN蛋白表達均高于對照組（t=3.46、2.98，P<0.05）。見圖2A、B和表3。茜素紅染色結果顯示，TLR3組紅色鈣質沉積明顯多于對照組（圖2C）。表明TLR3經Poly（I：C）活化后能夠促進hAMSCs成骨分化，加快鈣質沉積。

2.4?各組hAMSCs中NF-κB通路相關蛋白P65及p-P65表達比較

Western Blot結果顯示，NF-κB通路相關蛋白p-P65和P65表達較對照組明顯增加，差異有統計學意義（t=3.52、13.85，P<0.05）。見圖3、表4。

3?討?論

MSCs作為一類具有自我更新、多譜系分化、低免疫原性和免疫調節能力等多項優點的成體多能干細胞，目前在干細胞領域得到廣泛的研究[15]。由于MSCs具有以上多項優點，目前MSCs移植已成為骨質疏松等疾病最佳治療方法。但是在MSCs移植中經常有炎癥或感染情況發生，降低了MSCs移植的成功率與治療效果，而通過活化MSCs的TLR3介導hAMSCs免疫反應能夠抑制炎癥感染，提高MSCs移植的成功率和骨質疏松等疾病的治療效果。但是活化的TLR3是否會影響hAMSCs成骨分化，目前沒有定論。本實驗結果表明，hAMSCs活化TLR3后，成骨標志基因RUNX2和OCN的mRNA和蛋白表達均明顯增加，同時成骨誘導分化后鈣質沉積程度更高，表明hAMSCs經Poly（I：C）處理活化TLR3后可能促進hAMSCs成骨分化。

MSCs在成骨分化過程中受到多種信號通路的調控，包括Wnt信號通路、Notch信號通路、BMP/TGF-β信號通路、MAPK信號通路、hedghog信號通路、FGF信號通路、PTH信號通路和IGF-1信號通路等[16-19]，不同信號通路通過調控β-catenin、同源核蛋白MSX2和含有PDZ識別模體的轉錄輔助激活因子TAZ等因子的表達，上調成骨分化標志基因RUNX2和其下游基因OSX（osterix）的表達，提高堿性磷酸酶活性，調控成骨細胞特異性細胞外基質蛋白OCN表達和鈣離子沉積，促進MSCs向成骨細胞分化[20-21]。大量的研究結果證明，許多因素都能夠通過不同信號通路影響MSCs的成骨分化[22-28]，其中TLRs活化對MSCs的成骨分化也有影響。例如使用LPS持續刺激骨髓來源MSCs活化TLR4后能夠通過Wnt通路促進其增殖和成骨分化[29]。TLR2活化后也能夠顯著增強骨髓來源MSCs的成骨分化[30]。TLR9活化后能夠促進臍帶來源MSCs成骨分化而不影響其表型[31]。本實驗結果顯示，Poly（I：C）活化hAMSCs的TLR3后，NF-κB通路相關蛋白P65和p-P65表達明顯增加，表明hAMSCs的TLR3活化后可能通過激活NF-κB通路來上調成骨標志基因RUNX2和OCN的表達，促進hAMSCs成骨分化。但是具體作用機制仍不明確，需要進一步探討。

綜上所述，Poly（I：C）活化hAMSCs的TLR3后，能夠通過激活NF-κB通路上調hAMSCs成骨標志基因RUNX2和OCN mRNA和蛋白表達，加快鈣質沉積，促進hAMSCs成骨分化。因此，活化hAMSCs的TLR3不僅能夠抑制炎癥，提高MSCs的移植存活率，還能夠促進MSCs的成骨分化，加快鈣質沉積，有利于增強骨質疏松病人的骨修復能力，為一種可行的MSC預處理方式。但是活化TLR3后促進MSCs成骨分化涉及的基因及信號通路需要進一步研究[32-33]。本文研究結果可為hAMSCs在骨質疏松等老年退行性疾病中的應用提供了一定的研究基礎。

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（本文編輯?黃建鄉）