家蠶己糖激酶基因進化分析及其多轉錄本在胚胎早期發育過程中的表達特性

許瑾 邵云華 黃靜怡 沈廣勝 朱娟 王梅仙 唐順明 沈興家

摘要：【目的】明確家蠶（Bombyx mori）二化性品系胚胎早期發育過程中己糖激酶基因（BmHK）不同轉錄本的表達特性，為深入探究BmHK基因各轉錄本的生物學功能及揭示其在家蠶胚胎早期發育中的作用機制提供理論依據?！痉椒ā繌腘CBI檢索并下載家蠶等12種昆蟲的HK氨基酸序列，采用MEGA 7.0的鄰接法（NJ）構建基于HK氨基酸序列相似性的系統發育進化樹。以家蠶二化性品系秋豐活化越年蠶卵（丙2胚胎）為材料，分別制備非滯育命運卵（ND）、滯育命運卵（DD）和即時浸酸卵（IA），采用實時熒光定量PCR檢測BmHK基因各轉錄本在家蠶二化性品系胚胎早期發育過程中的表達特性?！窘Y果】BmHK基因屬于HSP70-actin家族，存在4個不同的轉錄本，其長度分別為4610、4608、2818和1520 bp，依次命名為BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d。BmHK-a在3種蠶卵胚胎早期發育過程中整體上呈先升高后降低的變化趨勢，且各時間點均表現為IA蠶卵>ND蠶卵>DD蠶卵，IA蠶卵中的BmHK-a相對表達量于發育2 h達峰值，在ND蠶卵和DD蠶卵中于發育48 h達峰值，此后其表達快速下調，至發育96 h均處于較低水平;BmHK-b在3種蠶卵中的表達水平整體上表現為IA蠶卵>ND蠶卵>DD蠶卵，3種蠶卵中的BmHK-b相對表達量變化趨勢基本一致，均隨發育時間推移呈逐漸上升趨勢;BmHK-c在3種蠶卵中的表達差異明顯，初產蠶卵中已有較高的表達水平，受精后迅速升高，至發育72 h后BmHK-c在3種蠶卵中的相對表達量再次升高;BmHK-d在3種蠶卵中的相對表達量整體上呈先升高后降低的變化趨勢，且各時間點均表現為ND蠶卵>IA蠶卵>DD蠶卵，但IA蠶卵中BmHK-d表達峰值出現的時間早于DD蠶卵和ND蠶卵?！窘Y論】BmHK-a和BmHK-d主要在家蠶胚胎早期發育（產卵或浸酸后3 d）過程中發揮重要作用;BmHK-b雖然也參與家蠶胚胎早期發育過程，但不是主要的糖代謝相關酶;BmHK-c與家蠶胚胎早期發育關系密切，通過糖酵解為胚胎發育提供能量。

關鍵詞： 家蠶;己糖激酶（HK）;轉錄本;滯育;糖酵解;胚胎早期發育

Abstract：【Objective】To clarify the expression characteristics of the different transcripts of the hexokinase gene （BmHK） in the early embryonic development stage of bivoltine silkworm（Bombyx mori）， and in order to provide a theoretical basis for further exploring the biological functions of each transcript of the BmHK gene and revealing the mechanism of action in the early embryonic development of silkworm. 【Method】The HK amino acid sequences of 12 species of insects including B. mori were obtained and downloaded from NCBI， and a phylogenetic tree based on the similarity of HK amino acid sequences was constructed using the neighbor-joining method（NJ） of MEGA 7.0. The non-diapause-destined eggs （ND）， diapause-destined eggs（DD） and immediately acid-treated eggs（IA） were prepared using Qiufeng activated hibernating eggs（C-2 embryos） of the silkworm bivoltine strain. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression characteristics of each transcript during the early embryonic development of silkworm. 【Result】The BmHK gene belonged to the HSP70-actin family， and there were 4 different transcripts with lengths of 4610， 4608， 2818， and 1520 bp， respectively named BmHK-a， BmHK-b， BmHK-c and BmHK-d. BmHK-a showed an overall trend of increasing first and then decreased during the early embryonic development of the three kinds of silkworm eggs. At each time point， it was expressed as IA silkworm eggs>ND silkworm eggs>DD silkworm eggs， in IA silkworm eggs the relative expression of BmHK-a reached a peak at 2 h of development， and reached a peak at 48 h of development in ND silkworm eggs and DD silkworm eggs. After that， its expression was rapidly down-regulated and remained at a low level until 96 h of development; expression level of BmHK-b in silkworm eggs in three species was as follows：IA silkworm eggs>ND silkworm eggs>DD silkworm eggs. The relative expression levels of BmHK-b in the three silkworm eggs had basically the same trend， and they all showed a gradual upward trend with the development time. The expression of BmHK-c in the three silkworm eggs was greatly different. The expression level in the first-laying silkworm eggs was already high， and it increased rapidly after fertilization. The relative expression level of BmHK-c in the three silkworm eggs at 72 h after deve-lopment increased again; the relative expression of BmHK-d in the three silkworm eggs showed an overall trend of first increasing and then decreasing， and at each time point it was ND silkworm eggs>IA silkworm eggs>DD silkworm eggs， but the peak of BmHK-d expression in IA silkworm eggs appeared earlier than DD silkworm eggs and ND silkworm eggs. 【Conclusion】 BmHK-a and BmHK-d mainly play an important role in the early embryonic development of the silkworm （3 d after laying eggs or soaking in acid）; although BmHK-b is also involved in the early embryonic development of the silkworm， it is not the main sugar metabolism related enzymes; BmHK-c is closely related to the early embryonic deve-lopment of the silkworm， and provides energy for embryonic development through glycolysis.

Key words： Bombyx mori; hexokinase（HK）; transcript; diapause; glycolytic; early embryonic development

0 引言

【研究意義】家蠶（Bombyx mori）是世界上最重要的經濟昆蟲之一，也是鱗翅目的一種重要模式生物（唐芬芬等，2019）。根據家蠶在自然條件下一年發生的世代數，可分為一化性、二化性和多化性品系，而多化性品系又分為有滯育多化性和無滯育多化性（呂鴻聲，1991）。家蠶胚胎滯育發生時的能量代謝途徑一直被認為是揭示家蠶滯育調控機制的關鍵（沈張飛等，2018;解鴻青等，2018）。糖酵解是糖代謝的重要方式，也是很多動物組織能量的源頭。己糖激酶（Hexokinase，HK）是糖酵解最先出現的生物酶，能反應生成丙酮酸參與三羧酸循環。HK廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物中，包含4種不同亞型，在進化過程中高度保守且與多種生理活動密切相關。HK能促進磷酸基團轉移，將葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，其活性的升高有助于家蠶胚胎發育，是家蠶發育的關鍵調節劑（許瑾，2020）。HK在滯育解除過程中還能催化葡萄糖轉化為氨基酸和脂肪等物質，產生大量能量，促進家蠶胚胎頭部和胸節的分化。因此，分析HK基因在家蠶胚胎早期發育過程中的表達特性，對解析二化性家蠶滯育的生理生化機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】家蠶滯育是一種非常典型的對光周期和環境溫度等主動適應機制（卓德干等，2010;張曉燕等，2015），二化性品系蠶卵常溫（25 ℃）明催青時產下滯育卵，而低溫（20 ℃以下）暗催青時產下非滯育卵（黃君霆，2003;顧燕燕等，2008）。在家蠶親代胚胎發生期，尤其是器官形成期，環境條件（高溫和長光照等）的變化會影響子代蠶卵形成階段蛹期咽下神經節（SG），促使其分泌滯育激素（DH）（Homma et al.，2006;梁瀚清等，2014）;分泌至血淋巴中的DH與卵巢細胞上的受體結合，啟動卵巢中海藻糖酶基因的表達，促進糖元積累，糖元再轉化為山梨醇和甘油，即滯育發生（黃君霆，2003;Hull et al.，2004;王力剛等，2011）。DH在滯育準備期通過調節碳水化合物即糖代謝，為家蠶卵滯育作準備。糖代謝是生物體內廣泛存在的代謝方式，包括由一系列酶促反應構成的分解代謝和合成代謝，是生命活動的能量和物質基礎（許瑾，2020）。在以家蠶二化性品系制備的滯育卵、非滯育卵及即時浸酸卵中，其超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙酮酸激酶（PK）、乙酰膽堿酯酶（AchE）和乳酸脫氫酶（LDH）的活性存在明顯差異（范蘭芬等，2011）。在昆蟲體內的能量代謝過程中，HK是糖代謝途徑的限速酶，具有催化己糖磷酸化的作用，生成的葡萄糖-6-磷酸是參與海藻糖合成、糖原合成及糖酵解過程的重要中間代謝產物（王力剛等，2011）。至今，有關果蠅（Drosophila melanogaster）、麥紅吸漿蟲（Sitodiplosis mosellana）、蔥蠅（Delia antiqua）及棉鈴蟲（Bombyx mori）等物種的HK基因表達特征及功能研究已有較多報道。成衛寧等（2009）研究表明，在麥紅吸漿蟲解除滯育過程中，其HK活力明顯升高，以促進體內糖酵解的順利進行;郭強等（2015）研究發現，蔥蠅的2個HK基因在夏季滯育時具有相同的表達規律，但在冬季滯育時呈現出相反的表達規律;Lin和Xu（2016）研究表明，HK在棉鈴蟲的滯育和壽命調節中發揮重要作用，且非滯育蛹中的HK表達水平顯著高于滯育蛹?！颈狙芯壳腥朦c】家蠶滯育卵胚胎發育早期的糖代謝以能量和物質貯存為主，而非滯育卵和即時浸酸卵的糖代謝以物質分解代謝為主（許瑾等，2020）。大部分真核生物轉錄的mRNA前體是以同一方式剪接出一類mRNA，但也有某些基因的mRNA前體是通過不同剪接方式而形成不同剪接異構體（Lee and Rio，2015）。通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索到家蠶HK基因（BmHK）存在4個不同轉錄本，均由同一基因可變剪接產生，但至今鮮見BmHK基因各轉錄本在家蠶胚胎早期發育過程中的表達特性及其影響家蠶滯育作用機制的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】根據NCBI檢索到BmHK基因的4個轉錄本設計特異引物，檢測各轉錄本在家蠶二化性品系胚胎早期發育過程中的表達特性，為深入探究BmHK基因各轉錄本的生物學功能及揭示其在家蠶胚胎早期發育中的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試家蠶二化性品系秋豐由江蘇省蠶桑生物學與生物技術重點實驗室保存提供。TRIzon總RNA提取試劑盒、HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix反轉錄試劑盒及UltraSYBR Mixture試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技有限公司。

1. 2 BmHK基因進化分析

從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索并下載12種昆蟲的HK氨基酸序列信息（表1），基于HK氨基酸序列相似性，采用MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining method，NJ）構建系統發育進化樹。

1. 3 蠶卵樣品制備

以家蠶二化性品系秋豐活化越年蠶卵（丙2胚胎）為材料，一部分蠶卵采用17 ℃暗催青，孵化后常規新鮮桑葉飼養，羽化后蛾區內交配，制備非滯育命運卵（Non-diapause-destined eggs，ND）;另一部分采用25 ℃明催青，飼養后制備滯育命運卵（Diapause-destined eggs，DD），25 ℃保護;20 h后取一部分DD蠶卵用鹽酸溶液（1.075 g/mL）于46 ℃下浸泡5 min，清水漂洗10 min后獲得即時浸酸卵（Immediately acid-treated eggs，IA），IA蠶卵從浸酸后計算其發育時間。IA蠶卵在浸酸前的發育同DD蠶卵，為滯育發育;浸酸后蠶卵滯育被打破，胚胎繼續發育，類似于ND蠶卵。3種蠶卵分別于發育0、2、6、12、24、48、72和96 h時取樣，-80 ℃保存備用。

1. 4 引物設計與合成

從NCBI檢索BmHK基因（LOC101745054）的4個轉錄本（XM_004932593.3、XM_021352245.1、XM_004932595.3和XM_004932594.3），以ClustalW（http：//www.clustal.org/）進行多序列比對分析，篩選出各轉錄本的特異片段，采用Primer 6.0分別設計上、下游引物（表2），并委托浙江尚亞生物技術有限公司合成。

1. 5 總RNA提取及cDNA合成

按TRIzon總RNA提取試劑盒說明提取蠶卵樣品總RNA：稱取100 mg不同蠶卵樣品，加200.0 μL TRIzon試劑，電動研磨器冰浴研磨30 s，4 ℃下12000 r/min離心5 min;收集上清液并轉移至新的1.5 mL EP管中，加入800.00 μL TRIzon試劑，混勻，室溫靜置5 min;加入200.00 μL氯仿，劇烈振蕩呈乳化狀，靜置5 min;4 ℃下12000 r/min離心15 min，小心吸取上層水相轉移至新的1.5 mL EP管中;加入等體積異丙醇，振蕩混勻，冰浴30 min，4 ℃下12000 r/min離心10 min;棄上清液，加入75%乙醇，離心后棄上清液，并向沉淀物中加入DEPC水，-80 ℃保存備用。在200 μL反應管中加入16.00 μL去RNA酶的ddH2O，4×gDNA wiper Mix 4.00 μL，RNA模板（總RNA）約1 μg，42 ℃孵育2 min，除去DNA;然后加入4.00 μL 5×qRT SuperMix II進行反轉錄，反應條件：50 ℃ 15 min，85 ℃ 2 min，反轉錄產物即為cDNA。

1. 6 實時熒光定量PCR檢測BmHK基因各轉錄本表達水平

以反轉錄合成的cDNA為模板、 Actin3基因為內參基因，參照蔣濤（2017）的方法進行實時熒光定量PCR檢測。實時熒光定量PCR反應體系10.00 μL：SYBR Primix Ex Taq 1.00 μL，ROX Reference Dye 6.00 μL，cDNA模板0.50 μL，上、下游引物各0.25 μL，ddH2O 2.00 μL。擴增程序：94 ℃預變性2 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，進行45個循環;95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 min。通過2-△△Ct法換算BmHK基因各轉錄本相對表達量（Zhu et al.，2019），采用Duncans新復極差法進行顯著性檢驗（Moribe et al.，2010），并以GraphPad Prism 6.0制圖。

2 結果與分析

2. 1 BmHK基因結構

BmHK基因屬于HSP70-actin家族，存在4個不同的轉錄本，其長度分別為4610、4608、2818和1520 bp（圖1），依次命名為BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d。其中，BmHK-a的編碼區（CDS）序列為16～1440 bp，全長1424 bp;BmHK-b的CDS序列為14～1438 bp，全長1424 bp;BmHK-c的CDS序列為1466～2818 bp，全長1352 bp;BmHK-d的CDS序列為159～1520 bp，全長1361 bp。

2. 2 BmHK基因進化分析結果

由圖2可看出，12種昆蟲的HK氨基酸序列可分為兩大分支，保守性較高;其中，BmHK氨基酸序列（XP_004923503.1）與野桑蠶HK氨基酸序列（XP_028037827.1）和煙草天蛾HK氨基酸序列（XP_030021779.1）聚類在一起，形成一個進化分支，說明三者在系統分類上親緣關系較近，而與菜粉蝶HK氨基酸序列（XP_022112731.1）所在分支的親緣關系較遠。

2. 3 BmHK基因各轉錄本的表達特性分析結果

2. 3. 1 BmHK-a表達特性 實時熒光定量PCR檢測結果（圖3）顯示，BmHK-a在IA蠶卵、ND蠶卵和DD蠶卵胚胎早期發育過程中（0～96 h）整體上呈先升高后降低的表達變化趨勢，且各時間點均表現為IA蠶卵>ND蠶卵>DD蠶卵。在IA蠶卵中，BmHK-a相對表達量于發育2 h達峰值，且在48 h內均保持高水平，但至發育48 h后快速下調;在ND蠶卵和DD蠶卵中，BmHK-a相對表達量在發育2～48 h期間均呈逐漸上升趨勢，至發育48 h達峰值，此后BmHK-a的表達也快速下調。至發育96 h，3種蠶卵中的BmHK-a相對表達量均處于較低水平。說明BmHK-a主要在蠶卵胚胎早期發育（產卵或浸酸后3 d）過程中發揮重要作用，為胚胎發育提供能量。

2. 3. 2 BmHK-b表達特性 實時熒光定量PCR檢測結果（圖4）顯示，BmHK-b在家蠶二化性品系不同處理蠶卵中的表達水平整體上表現為IA蠶卵>ND蠶卵>DD蠶卵。在DD蠶卵中，BmHK-b相對表達量隨發育時間的推移呈非常緩慢上升趨勢，但變化差異不明顯;在ND蠶卵中，BmHK-b相對表達量的變化趨勢與DD蠶卵的基本一致;在IA蠶卵中，BmHK-b的表達在浸酸處理后72 h內呈緩慢上調趨勢，從72 h后開始快速上調，至發育96 h達峰值。說明BmHK-b參與家蠶胚胎早期發育過程，但不是主要的糖代謝相關酶。

2. 3. 3 BmHK-c表達特性 實時熒光定量PCR檢測結果（圖5）顯示，DD蠶卵發育2 h后，BmHK-c相對表達量快速升高，然后逐漸下降，于發育24 h降至最低值，而后又逐漸上升;在ND蠶卵中，BmHK-c相對表達量呈上升—下降—上升的變化趨勢，于發育12 h達峰值，然后迅速下降，至發育24 h達最低值，之后又呈逐漸上升趨勢;在IA蠶卵中，BmHK-c相對表達量在浸酸處理后2 h快速上升至較高水平，之后下降并穩定在較低水平，至發育72 h后再次快速上升。說明BmHK-c與家蠶胚胎早期發育密切相關，通過糖酵解為胚胎發育提供能量。

2. 3. 4 BmHK-d表達特性 實時熒光定量PCR檢測結果（圖6）顯示，BmHK-d在家蠶二化性品系不同處理蠶卵中的相對表達量整體上呈先升高后降低的變化趨勢，且各時間點均表現為ND蠶卵>IA蠶卵>DD蠶卵。在DD蠶卵中，BmHK-d相對表達量在發育前12 h處于較低水平且變化不明顯，然后快速上升，至發育24 h達峰值，隨后逐漸下降;在ND蠶卵中，BmHK-d表達水平最高，其相對表達量在發育前24 h呈逐漸升高趨勢，至發育24 h達峰值，之后逐漸下降，但仍維持在較高水平;在IA蠶卵中，BmHK-d相對表達量于發育12 h達峰值，之后逐漸下降，從發育72 h后快速下降。IA蠶卵中BmHK-d表達峰值出現的時間早于DD蠶卵和ND蠶卵，可能與IA蠶卵以浸酸后為計時起點有關，峰值出現時間實際是在產卵后32 h。BmHK-d主要在蠶卵胚胎早期發育過程中發揮重要作用，但在ND蠶卵發育48～96 h仍有較高水平的穩定表達，可能與ND蠶卵胚胎發育迅速有關。

3 討論

真核生物mRNA前體剪接是基因轉錄后表達調控的重要步驟，可變剪接廣泛存在于高等生物中（Kim et al.，2007）。人類基因平均含有8個外顯子，所有的基因都能發生可變剪接，并產生2個以上的mRNA異構體（Lee and Rio，2015）。已有研究證實，家蠶神經肽Orcokinin基因（BmOK）存在選擇性剪接，產生2個轉錄本（BmOKA和BmOKB），BmOK參與色素合成調控，是2種類鶉斑突變體（q-lp和q-lb）形成的主要原因（Wang et al.，2019）;家蠶通過對Bmdsex結合蛋白的選擇性剪接，而調控其性別分化（Zheng et al.，2019）。HK在棉鈴蟲滯育中發揮重要作用，且非滯育蛹中的HK表達水平顯著高于滯育蛹（Lin and Xu，2016）。本課題組的前期研究也表明，家蠶非滯育卵和即時浸酸卵中的BmHK表達水平明顯高于滯育卵（許瑾等，2020）。

由于BmHK基因存在4個不同的轉錄本（BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d），為此本研究設計4個轉錄本的特異引物，通過實時熒光定量PCR檢測各轉錄本在家蠶二化性品系不同處理蠶卵中的表達情況。BmHK-a在DD蠶卵、ND蠶卵和IA蠶卵胚胎早期發育過程中的表達模式相似，受精（發育2 h）后的相對表達量迅速上升，其峰值基本接近且均出現在產卵或浸酸后48 h，此后BmHK-a相對表達量快速下降，至發育96 h達最低，說明BmHK-a是家蠶胚胎早期發育過程中HK的主要活性形式。BmHK-b在3種蠶卵中的表達模式基本一致，在初產蠶卵中已有一定的表達量，隨著發育時間的推移，其相對表達量緩慢上升，說明BmHK-b參與家蠶胚胎早期發育過程，但不是胚胎早期發育過程中HK的主要活性形式。IA蠶卵中的BmHK-b相對表達量隨著發育時間的推移呈逐漸上升趨勢，并在發育96 h達峰值，可能是其胚胎（戊3～己1）快速發育需要更多能量。BmHK-c在DD蠶卵、ND蠶卵和IA蠶卵中的表達差異明顯，初產蠶卵中有較高的表達水平，可能是母體為子代胚胎發育所提供，受精后迅速上升至較高水平，推測BmHK-c可能參與蠶卵的受精過程;在DD蠶卵和IA蠶卵中，受精后（6～72 h）的BmHK-c相對表達量降至較低水平（接近產卵初期），在ND蠶卵中于發育12 h出現峰值，與ND蠶卵胚胎快速發育有關;至發育72 h后，BmHK-c在3種蠶卵中的相對表達量再次升高，成為HK的主要活性形式。BmHK-d在3種蠶卵中的相對表達量整體上呈先升高后降低的變化趨勢，且各時間點均表現為ND蠶卵>IA蠶卵>DD蠶卵;IA蠶卵中BmHK-d表達峰值出現的時間早于DD蠶卵和ND蠶卵，可能與IA以浸酸后為計時起點有關，實際是在產卵后32 h出現峰值，說明浸酸處理并未影響BmHK-d表達。此外，在DD蠶卵和IA蠶卵（源自滯育命運蠶卵）中，BmHK-d相對表達量在發育96 h均降至最低水平，而ND蠶卵中的BmHK-d表達仍維持在較高水平，表明BmHK-d在DD蠶卵和IA蠶卵胚胎早期發育過程中發揮作用，之后的作用減弱;而在ND蠶卵中即使96 h后仍發揮重要作用，可能與ND蠶卵胚胎發育迅速有關。

綜上所述，BmHK基因4個轉錄本在來源于家蠶二化性品系滯育蠶卵、非滯育蠶卵和即時浸酸蠶卵胚胎早期發育過程中的表達水平存在差異，且各自在不同發育階段和水平上發揮功能作用，但有關BmHK基因參與二化性蠶卵滯育的調控機制還有待進一步探究。因此，下一步將采用Western blotting從蛋白水平研究這些轉錄本的表達水平，或通過RNAi分別抑制BmHK基因各轉錄本表達，進而深入探究BmHK基因的生物學功能。

4 結論

BmHK-a和BmHK-d主要在家蠶胚胎早期發育（產卵或浸酸后3 d）過程中發揮重要作用;BmHK-b雖然也參與家蠶胚胎早期發育過程，但不是主要的糖代謝相關酶;BmHK-c與家蠶胚胎早期發育關系密切，通過糖酵解為胚胎發育提供能量。

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（責任編輯 蘭宗寶）