pH、氨氮和亞硝酸鹽對單環刺螠稚螠耗氧率和排氨率的影響

張賽賽，董美艷，田斌，孫陽，陳穎，周竹君，宋曉陽，楊婷婷，劉彤，陳文博

（1.大連市現代農業生產發展服務中心，遼寧 大連 116023；2.瓦房店市漁業事務服務中心，遼寧 瓦房店 116300）

單環刺螠Urechis unicinctus 俗稱海腸，屬螠蟲動物門Echiuroide、螠綱Echiuride、無管螠目Xenopneusta、刺螠科Urechidae[1]，分布范圍較廣，如俄羅斯、日本、朝鮮和我國的環渤海沿岸，主要生活在泥沙岸潮間帶下區及潮下帶淺水區，主要濾食水中有機質和浮游生物。單環刺螠口感鮮美，營養和藥用價值高，價格不斷攀升，成為我國北方新興的海水養殖種類。近年來，野生單環刺螠資源明顯下降，人工繁育應運而生，相關研究日漸增多。目前對單環刺螠的人工繁育技術[2]、營養成分[3]、基礎生物學[4,5]和分子生物學[6,7]等已有較多研究。

耗氧率和排氨率是生物能量代謝的主要指標，能夠反映養殖生物對環境的適應性和養殖特性，為人工養殖和生態學研究提供重要的數據支持。水生生物能量代謝受內外兩方面因素的影響，即種類、規格、發育階段等生物自身因素和光照、溫度、鹽度、pH 等外部環境因素[8]。張志峰等[9]研究了不同硫化物濃度下單環刺螠的呼吸代謝酶類活性的變化；王愛敏等研究了不同氨氮濃度及鹽度下單環刺螠的耗氧率[10]；孫濤等研究了不同pH 下單環刺螠耗氧率和排氨率的變化[11]。但是，單環刺螠在pH 和氨氮脅迫下呼吸排泄、規格和氨氮濃度的影響等還有待完善。本研究采用靜水密封法，探討了6 個pH梯度、5 個氨氮和亞硝酸鹽濃度下體質量（1.52±0.12）g 的單環刺螠呼吸代謝的適應情況，并為工廠化養殖環境的管理提供數據參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗用單環刺螠系人工繁育培養，帶水運輸到實驗室暫養在底部鋪細沙的50 L 塑料方槽內。一周暫養期間，每天上午投喂一次，下午換水1/2，細沙上方懸掛氣石，保持溶氧充足。

暫養用海水為經沉淀、砂濾的潔凈自然海水，水溫14.5～17.0℃，鹽度32.17～32.28，pH7.88～8.15，氨氮1.058×10-2～4.338×10-2mg/L，亞硝酸鹽1.68×10-3～2.79×10-3mg/L，符合海水水質一類標準。

1.2 方法

實驗用容積500 mL 瓶子，每瓶4 只單環刺螠，采用靜水密封法測量生物呼吸，1 個空白對照組和3 個實驗組。實驗處理3 h，開始前后按標準操作取水樣。采用《海洋監測規范第4 部分：海水分析GB17378.4-2007》碘量法和次溴酸鈉氧化法測定耗氧率和排氨率。

實驗用NaOH 和HCL 溶液調配，設5 個pH 梯度（6、7、8、9、10），以相隔10 min 測量兩次結果不超過0.05 為穩定pH。暫養1 周后，對單環刺螠稚螠進行pH 馴化后開始實驗。根據自然海水和工廠化養殖中可能出現的氨氮和亞硝酸鹽濃度設置梯度，使用氯化銨和亞硝酸鈉配置的100 g/L 母液配置相應濃度海水后，根據實測濃度為準，設氨氮濃度0.0699 mg/L、0.0736 mg/L、0.1560 mg/L、0.6150 mg/L 和1.0200 mg/L，亞硝酸鹽濃度0.0198 mg/L、0.0256 mg/L、0.0502 mg/L、0.0738 mg/L 和0.4960 mg/L。每個梯度設置三個平行和一個空白對照組。

實驗設置持續5 h 的耗氧率變化。設置五個實驗組，每組三個平行，均使用正常海水，每瓶放置4只單環刺螠，同時開始實驗，隔1 h 結束一組，測定實驗前后水樣中的溶解氧量，計算單環刺螠耗氧率。

1.3 數據計算與處理

采用下式計算耗氧量、耗氧率和排氨量、排氨率：

式中：DO0、DOt分別為實驗組起始和t 時的溶解氧量（mg/L）；C0、Ct分別為空白對照組始、末溶氧量（mg/L）；V 為呼吸瓶體積，0.5 L；m 為單環刺螠的體質量（g）；t 為實驗持續時間（h）。

RNN是單位體質量排氨量[mg/（g·h）]；N0、Nt表示實驗組始、末氨氮含量（mg/L）；CN0、CNt分別為空白對照組始末氨氮含量（mg/L）。

氧氮比O/N=R00/RNN，單環刺螠耗氧與排氨的克原子比值[12]。

能量代謝率M=QOX·OR，式中M 為單環刺螠單位質量的能量代謝率[J/（g·h）]，為氧卡系數，其值采用13.54 J/mg[11]。

實驗數據以平均值±標準差表示，用SPSS 20.0統計軟件進行ANOVO-單因素方差分析；組間差異用Duncan 法作多重比較；顯著水平設置為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 溶解氧量對單環刺螠代謝的影響

單環刺螠在密封呼吸瓶中的耗氧量和耗氧率隨時間的變化見圖1。由圖1 可知：耗氧量和耗氧率隨時間的延長而逐漸減少，在前2 h 內，耗氧量和耗氧率緩慢降低，第2～4 h 內，耗氧量和耗氧率快速下降，第4 h 以后，耗氧量和耗氧率下降變化不明顯，達到最低值。第1～2 h 的耗氧率差異不顯著（P＞0.05），顯著高于第3 h、4 h、5 h 的耗氧率（P＜0.05），后兩者差異不顯著（P＞0.05），顯著低于第3 h（P＜0.05）。

圖1 單環刺螠耗氧率隨時間的變化Fig.1 Changes in oxygen consumption rate of echiuran worm with the time

隨時間延長呼吸瓶中氧濃度下降，能量代謝率與耗氧量和耗氧率變化規律有相似的結果，即隨時間的增加，能量代謝率總體下降。第1 h 和第2 h、第4 h 和第5 h 的能量代謝率差異不顯著（P＞0.05）。第1 h 和第2 h 的能量代謝率顯著高于第3 h、4 h 和5 h（P＜0.05）；第3 h 顯著高于第1 h 和第5 h（P＜0.05）（圖2）。

圖2 單環刺螠能量代謝率隨時間的變化規律Fig.2 Changes in energy metabolism rate of echiuran worm with the time

2.2 pH 變化對單環刺螠代謝的影響

pH 對單環刺螠耗氧量和耗氧率的影響見圖3。由圖3 可知，隨著pH 升高，耗氧量和耗氧率先升高后降低。當pH 為8 時，耗氧量和耗氧率達到峰值，顯著高于pH 為6、7、10（P＜0.05）；pH 為6 時耗氧率顯著小于pH 為8、9 時（P＜0.05）；pH 為7、9、10 時，耗氧率差異不顯著（P＞0.05）?；貧w分析顯示，單環刺螠pH 和耗氧率兩者呈二次多項式關系：Y=-0.008X2+0.0543X-0.0141（R2=0.8833，X=pH，Y=耗氧率）。

圖3 pH 對單環刺螠耗氧量和耗氧率的影響Fig.3 Effects of pH on oxygen consumption and oxygen consumption rate of echiuran worm

pH 對單環刺螠排氨量和排氨率的影響見圖4。由圖4 可知，排氨量和排氨率呈先升高后降低的趨勢。當pH 超過7 時，排氨量和排氨率顯著減?。≒＜0.05）。單環刺螠排氨率與pH 的回歸方程為二次多項 式：Y=-0.0002X2+0.0005X+0.0081（R2=0.6287，X表示pH，Y 表示排氨率）。

圖4 pH 對單環刺螠排氨量和排氨率的影響Fig.4 Effects of pH value on amount and rate of ammonia excretion of echiuran worm

pH 對單環刺螠氧氮比（O/N）和能量代謝率的影響見圖5 和圖6。由圖5 和圖6 可知，氧氮比和能量代謝率呈明顯的先升高后降低趨勢，當pH=8 時，氧氮比和能量代謝率均達最大值（P＜0.05）。

圖5 不同pH 下單環刺螠的氧氮比Fig.5 The oxygen nitrogen ratio（O/N）of echiuran worm exposed to various pH values

圖6 不同pH 下單環刺螠的能量代謝率Fig.6 The energy metabolic rate of echiuran worm exposed to various pH values

2.3 氨氮含量的變化對單環刺螠代謝的影響

由圖7 可知：隨著氨氮濃度的升高，單環刺螠的耗氧量和耗氧率先下降后趨平穩（圖7）。氨氮為0.0699 mg/L 時，耗氧量和耗氧率最高，分別為0.6700 mg/h 和0.1100 mg/g·h。氨氮為0.0736～1.0200 mg/L時，耗氧率之間無顯著差異（P＞0.05）。對單環刺螠氨氮濃度和耗氧率的回歸關系呈冪函數：Y=0.1101X-0.487（R2=0.7153，X 為氨氮濃度，Y 為耗氧率）。

圖7 氨氮對單環刺螠耗氧量和耗氧率的影響Fig.7 Effects of ammonia nitrogen on oxygen consumption and oxygen consumption rate of echiuran worm

氨氮對單環刺螠排氨量和排氨率的影響見圖8。在氨氮為0.0699～1.0200 mg/L 時，各組單環刺螠的排氨率沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖8 氨氮對單環刺螠排氨量和排氨率的影響Fig.8 Effects of ammonia nitrogen on amount and rate of ammonia excretion of echiuran worm

氨氮對單環刺螠呼吸代謝的氧氮比和能量代謝率的影響見圖9 和圖10。由圖9 和圖10 可知：隨著氨氮濃度升高，氧氮比波動式變化，最后下降，當氨氮為0.0699 mg/L 時，氧氮比最高28.66。隨著氨氮濃度升高，單環刺螠的能量代謝率先下降，后平穩。氨氮為0.0699 mg/L 時，能量代謝率最大1.48 J/g·h（P＜0.05）。

圖9 不同氨氮濃度下單環刺螠的氧氮比Fig.9 The oxygen nitrogen ratio of echiuran worm exposed to different ammonia nitrogen concentrations

圖10 不同氨氮濃度下單環刺螠的能量代謝率Fig.10 The energy metabolic rate of echiuran worm exposed to different ammonia nitrogen concentrations

2.4 亞硝酸鹽含量的變化對單環刺螠代謝的影響

亞硝酸鹽含量對單環刺螠耗氧量和耗氧率的影響見圖11。由圖11 可知，隨著亞硝酸鹽濃度的增加，單環刺螠的耗氧量和耗氧率先升高后下降。當亞硝酸鹽濃度為0.0502 mg/L 時，耗氧量和耗氧率達最大峰值；當亞硝酸鹽濃度為0.4960 mg/L 時，耗氧量和耗氧率值最低，最低和最高的耗氧率差異顯著（P＜0.05）。亞硝酸鹽濃度與單環刺螠耗氧率呈二次多項式關系：Y=-0.0066X2+0.0357X+0.0361（R2=0.9289，X 為亞硝酸鹽濃度，Y 為耗氧率）。

圖11 亞硝酸鹽濃度對單環刺螠耗氧量和耗氧率的影響Fig.11 Effects of nitrite concentration on amount and rate of oxygen consumption in echiuran worm

亞硝酸鹽含量對單環刺螠的排氨量和排氨率的影響見圖12。由圖12 可知，亞硝酸鹽濃度為0.0256 mg/L 和0.0738 mg/L 時，單環刺螠的排氨量和排氨率高于其他三組，各組間差異不顯著（P＞0.05）。亞硝酸鹽濃度為0.4960 mg/L 時，排氨量和排氨率最低。

圖12 亞硝酸鹽對單環刺螠排氨量和排氨率的影響Fig.12 Effects of nitrite concentration on amount and rate of ammonia excretion in echiuran worm

亞硝酸鹽對單環刺螠呼吸氧氮比和能量代謝率的影響見圖13 和圖14。由圖13 和圖14 可知：隨著亞硝酸鹽濃度的升高，氧氮比先升高后下降，當亞硝酸鹽濃度為0.0502 mg/L 時，氧氮比最高，且與硝酸鹽為0.0256 mg/L 時差異顯著（P＜0.05）。隨著亞硝酸鹽濃度的增加，單環刺螠的能量代謝率先升高后下降。亞硝酸鹽濃度為0.0502 mg/L 時，能量代謝率最高，與亞硝酸鹽為0.4960 mg/L 時差異顯著（P＜0.05）。

圖13 不同亞硝酸鹽濃度下單環刺螠的氧氮比Fig.13 The oxygen nitrogen ratio of echiuran worm exposed to different nitrite concentrations

圖14 不同亞硝酸鹽濃度下單環刺螠的能量代謝率Fig.14 The energy metabolic rate of echiuran worm exposed to different nitrite concentrations

3 討論

3.1 溶解氧濃度對單環刺螠代謝的影響

耗氧率和排氨率為生物體呼吸代謝水平的重要指標。本實驗中單環刺螠耗氧量和耗氧率隨時間的延長逐漸降低，前2 h 呼吸瓶中溶氧充足，耗氧量和耗氧率高于其他各組。2 h 后隨著單環刺螠的呼吸代謝耗氧，呼吸瓶中溶氧量降低，單環刺螠呼吸略受限，耗氧量和耗氧率滑坡式下降，表明其呼吸代謝機能減弱。4 h 以后單環刺螠的呼吸代謝進一步受到氧濃度降低的限制，耗氧量和耗氧率達到最低值，且第4 h 和第5 h 的耗氧量和耗氧率無顯著變化（P＞0.05），說明4 h 后單環刺螠呼吸代謝受到顯著影響。

能量代謝率反映生物代謝能力，適宜條件下新陳代謝旺盛，活動能力強，生長快速。本實驗也反映了在溶氧充足的條件下，單環刺螠活動能力強，能量消耗率高，溶氧受限時抑制了呼吸代謝，活動能力下降。因此在工廠化養殖中，為不影響單環刺螠生長代謝需保持溶解氧充足，以利于單環刺螠生長。

3.2 pH 對單環刺螠代謝的影響

3.2.1 pH 對單環刺螠耗氧率和排氨率的影響

pH 是水生動物環境中重要的理化指標之一，pH 變化會直接影響水生動物的生理代謝，因此，pH是工廠化養殖所關注的重要水環境指標。本實驗中，隨著pH 的升高，單環刺螠的耗氧量和耗氧率呈先升高后下降的趨勢。pH 為8 時，耗氧量和耗氧率達到峰值；pH 為10 時，耗氧量和耗氧率較pH 為8顯著下降。推測這有兩種可能：其一，pH 升至8 時為單環刺螠適宜生存條件，代謝增強，pH 升至10時，單環刺螠不適應，代謝下降；其二，pH 的升高單環刺螠耗氧量和耗氧率升高是為了獲得更多的能量，補償性提高呼吸代謝，對抗環境pH 升高對自身的傷害。研究發現，弱堿性環境下水生生物呼吸代謝能力增強。唐保軍等[13]研究發現，pH 為8 時，細角螺Hemifusus termatamus 的耗氧率最高，pH 升高或降低，細角螺耗氧率均顯著降低。pH 為7.1 和8.9時，田螺Viviparus.contectoides 出現耗氧率峰值，而pH 升高或降低，其耗氧率均下降[14]。日本沼蝦Macrobrachium nipponensis[15]等水生生物也有類似結果。許星鴻等[16]采用正交實驗法研究了不同鹽度、pH 及溫度對單環刺螠腸消化酶活力的影響，發現鹽度25～35、pH6～9 為單環刺螠較適宜的環境條件，與本實驗結果一致。孫濤等[11]研究pH 對單環刺螠呼吸排泄的影響時得出，pH5～9 條件下，pH 值變化顯著影響單環刺螠的耗氧率和排氨率。單環刺螠的耗氧率隨pH 升高呈先上升后下降的趨勢，pH 為8 時出現最大值，此時單環刺螠呼吸代謝最旺盛。本實驗中，pH 在6～10 條件下，單環刺螠的耗氧率隨pH 升高呈先上升后下降的趨勢，pH8 時為最大值，說明單環刺螠在弱堿性環境中代謝旺盛。

本實驗中，單環刺螠的排氨量和排氨率隨pH的升高先升高后降低，pH 為7 時達峰值。pH 超過7以后，排氨率顯著下降，8～10 之間差異不顯著（P＞0.05）。排氨量和排氨率變化趨勢與耗氧量和排氨率接近，表明pH 為7～8 時為單環刺螠呼吸和代謝的適宜條件。

3.2.2 pH 對單環刺螠氧氮比和能量代謝率的影響

氧氮比（O/N）表示生物體內蛋白質、脂肪和碳水化合物分解代謝之間的關系。O/N 大表明動物消耗的能量主要由脂肪和糖提供。Mayza-lld[17]提出：O/N 約為7 時，生物體能量完全由蛋白質氧化提供；Ikeda[18]認為，O/N 約為24 時，生物體所需能量由蛋白質和脂肪氧化提供。當能量物質主要為脂肪或碳水化合物時，O/N 將變為無窮大[19]。本實驗中，隨著pH 的升高，氧氮比先升高后緩慢降低，pH8 時最大，pH9 時略有降低但不顯著（P＞0.05）。pH7 以后氧氮比均大于7，pH8 時氧氮比最大為10.48，說明在pH 小于8 時，單環刺螠主要消耗蛋白質提供能量。pH8 及以后，代謝能源物質由蛋白質轉為蛋白質和脂肪。

當pH 為8 時能量代謝率達到峰值，pH 為7、9、10 時，三組的能量代謝率差異不顯著（P＞0.05），說明pH 為8 左右時，單環刺螠生活條件適宜。

3.3 氨氮對單環刺螠代謝的影響

3.3.1 氨氮對單環刺螠耗氧率和排氨率的影響

游離氨NH3不帶電荷，易通過細胞膜，毒性比銨鹽大幾十倍[20]。氨氮影響單環刺螠、日本沼蝦和河蚌Anodonta woodiana 耗氧率[21]。本實驗中，單環刺螠稚螠隨氨氮濃度增加耗氧量和耗氧率的變化呈先下降，后相對平穩，又下降的趨勢。氨氮為0.0699 mg/L 時，耗氧量和耗氧率值最高；氨氮為1.0200 mg/L 時，耗氧量和耗氧率值最低。說明單環刺螠有一定的適應氨氮濃度變化的能力，以至于當氨氮為0.0736～0.6150 mg/L 時，可以維持耗氧量和耗氧率的相對平穩。隨著氨氮濃度繼續升高，耗氧量和耗氧率值再次下降。但氨氮在0.0736～1.0200 mg/L 范圍時，各組耗氧率差異不顯著（P＞0.05），這可能是其對海底環境長期適應的結果。海洋底層溶解氧量較低，浮游植物分布少，氨氮難以吸收，底層氨氮含量普遍高于表層[22]，單環刺螠經過長期的進化與環境相適應，具備相應生態位生物的生理結構功能，適應其特殊的生長環境。

本實驗設定的氨氮梯度下，各組單環刺螠的排氨率沒有顯著差異（P＞0.05），說明氨氮0.0699～1.0200 mg/L 對單環刺螠排氨率影響較小。

3.3.2 氨氮濃度對單環刺螠氧氮比和能量代謝率的影響

Widdows[23]認為，盡管尚未證明O/N 差異值對機體的生長速率和個體生長狀況有直接影響，但很多跡象表明，O/N 的變化與機體所受的壓力有密切的聯系，O/N 可以作為生物對環境適應程度的一項指標。本實驗數據表明，當氨氮濃度為1.0200 mg/L時，O/N 超過24.0，能量物質由脂肪和碳水化合物組成；度繼續升高后O/N 下降，但均大于7.0，能量代謝物由脂肪和碳水化合物轉變成蛋白質和脂肪，脂肪占比增大、代謝產能量升高，維持正常的生理代謝，這可能是單環刺螠感受到環境中氨氮毒性壓力，改變代謝來加大能量消耗，抵御環境中氨氮的毒性對身體的傷害。

3.4 亞硝酸鹽含量對單環刺螠代謝的影響

隨著集約化水產養殖模式的發展，殘餌、養殖動物代謝廢物長期積累，導致養殖水環境和底泥環境不斷惡化。亞硝酸鹽含量超標是集約化養殖容易出現的問題。亞硝酸鹽長期超標會使動物血液載氧能力下降，輕者影響生長，重則導致養殖動物中毒死亡，因此必須重視[24]。本實驗中，單環刺螠的耗氧量和耗氧率隨亞硝酸鹽濃度的增加先升高后下降。前四組的耗氧率無顯著差異（P＞0.05），而最后一組的耗氧率又與前兩組沒有顯著差異（P＞0.05）。這說明單環刺螠對水環境中亞硝酸鹽濃度耐受范圍較寬。

在本實驗設定的亞硝酸鹽濃度下，O/N 大于24，且各組的氧氮比無顯著差異（P＞0.05），表明代謝供能主要是消耗脂肪和碳水化合物，適應不同亞硝酸鹽濃度的變化，以維持機體正常代謝。