氨氮降解菌株的篩選及降解性能研究

張國偉，靳靜晨，李晨晨，高宇軒，高雅娟，張聞天，靳永勝*

1.北京農學院生物與資源環境學院，北京102206；

2.北京環氧環?？萍及l展有限公司，北京100101

目前，我國氨氮污染排放量已遠遠超出受納水體的環境容量，氨氮指標已超過化學需氧量（chemical oxygen demand，COD）指標成為影響地表水環境質量的首要指標［1］，且大量研究表明，氨氮指標超標會使江河湖泊水體逐漸富營養化［2-5］。為防止水體環境不斷惡化，國家對主要污染物，如氮、磷的排放制定了嚴格的標準，目前生物除氮因具有低耗、高能、可持續性強等特點廣泛應用于污水處理廠［6］。

科學家已發現了大量具有氨氮降解能力的菌株，如假單胞菌（Pseudomonassp.）［7-10］、糞產堿菌（Alcaligenes faecalis）［11］、芽 孢 桿 菌（Bacillussp.）［12］、酵母［13-14］等。目前越來越多的真菌被證實同樣具有去氮的能力，如李偉斯［15］從河流底泥中篩選出1株鏈格孢屬（Alternariasp.）真菌，其能夠利用多種有機碳源進行生長和反硝化；楊曉華［16］從焦化廢水處理單元活性污泥中篩選出1株鐮刀菌屬（Fusariumspp.）絲狀真菌，具有較強的適應能力，初始濃度為450 mg·L-1氨氮的去除率為94.75%。劉志云［17］從雞糞中篩選出1株擬宛氏青霉菌HL，在初始氨氮濃度為300 mg·L-1時，菌株HL的氨氮降解率為80.53%；戚文靜等［18］從活性污泥中篩選出1株Galactomyces屬的菌株AD-7，初始氨氮濃度291.16 mg·L-1，接種量2.21%時氨氮降解率預測值為100%，實測值仍可達到99%；曾忠強等［19］將白腐真菌絲狀生物膜固定在中空的脈管載體上，構建的新型白腐真菌反應器可以控制氣泡和廢水流完成18批次（共進行401 d）的垃圾滲濾液連續處理，氨氮含量指標（ammonia nitrogen content index，NH3-N）和COD去除率分別達83%～97%和56%～74%。本研究從垃圾滲濾液中分離篩選出1株具有降解高氨氮能力的真菌，對其進行形態學和分子鑒定，并分析了該菌的氨氮降解特性，旨在為污水中去除氨氮提供安全、有效、經濟的功能菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 由北京南宮垃圾堆肥廠的垃圾滲濾液中篩選出1株具有氨氮降解能力的菌株。

1.1.2 培養基配比 富集培養基：葡萄糖5.0 g·L-1，（NH4）2SO42.0 g·L-1，FeSO·47H2O 0.4 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1，MgSO·47H2O 0.5 g·L-1，其余為去離子水，pH為7.2～7.4。

分 離 培 養 基：葡 萄 糖5.0 g·L-1，（NH4）2SO42.0g·L-1，FeSO·47H2O 0.4 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1，MgSO·47H2O 0.5 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，其余為去離子水。

篩 選 培 養 基：葡 萄 糖5.0 g·L-1，（NH4）2SO40.6 g·L-1，NaCl 1.0 g·L-1，FeSO·47H2O 0.05 g·L-1，K2HPO40.5g·L-1，MgSO·47H2O 0.25g·L-1，其余為去離子水。

1.1.3 主要試劑與儀器 納氏試劑購于河南標準物質研發中心；酒石酸鉀鈉、過硫酸鉀、葡萄糖、蔗糖、紅糖、可溶性淀粉、硫酸銨、七水合硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂以及其他主要試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。以上藥品均為分析純。DJS-2013R-2恒溫搖床購于上海世平實驗設備有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺購于蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；YP30002電子天平購于上海越平科學儀器蘇州制造有限公司；UV-5500紫外可見分光光度計購于上海元析儀器有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋購于日本SANYO公司；22331離心機購于德國Eppendorf公司；LBY純水儀購于北京龍碧源水處理設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離純化和篩選 取滲濾液10 mL，接種于100 mL滅菌后的富集培養基中，充分搖勻，在溫度為30℃、轉速180 r·min-1的條件下振蕩培養，富集7 d，每隔1 d補加0.5 g（NH4）2SO4。富集后經梯度稀釋均勻涂布于分離培養基的平板上，在30℃培養箱倒置恒溫培養，挑取平板上長出的單菌落進行重復分離純化，直至得到單一菌株，命名為Z-5。

1.2.2 菌株的分子鑒定 利用TIAGEN真菌試劑盒提取菌株Z-5的DNA，然后以其DNA為模版、以27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）與1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）為引物，采用PCR儀擴增其內源轉錄間隔區（internally transcribed spacer，ITS）序列，擴增后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR產物送至英濰捷基（上海）貿易有限公司測序，利用測序結果在NCBI上進行Blast比對，并用MEGA 5.0做系統發育樹。

1.2.3 單一因素最優條件試驗 將菌株Z-5接種于100 mL篩選培養基中，置于30℃下、180 r·min-1搖床中進行培養，每24 h取樣測定其氨氮濃度，其中不同的培養條件設置如下。①不同接種量：接種量分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，氨氮初始濃度為100 mg·L-1，碳源為葡萄糖，pH為6.0，培養時間為5 d；②不同初始氨氮濃度：氨氮濃度分別為100、250、500、750、1 000 mg·L-1，接種量為1%，碳源為葡萄糖，pH為6.0，培養時間為7 d；③不同碳源：碳源分別為葡萄糖、蔗糖、紅糖、可溶性淀粉，接種量為1%，氨氮濃度為100 mg·L-1，pH為6.0，培養時間為3 d；④不同pH：pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接種量為1%，氨氮初始濃度為100 mg·L-1，碳源為紅糖，培養時間為4 d。

1.2.4 正交試驗 以100 mg·L-1氨氮為初始氮源，設計L（933）正交試驗，3個因素分別為A：氨氮初始濃度；B：碳源；C：pH（表1）。

表1 因素水平表Table 1 The factors and levels scale

1.2.5 氨氮檢測方法將待測樣品用去離子水稀釋到合適的倍數，然后用納氏試劑分光光度法進行氨氮的測定。氨氮具體測定方法參考Fei等［12］納氏試劑分光光度法。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態特征

觀察菌株Z-5在固體分離培養基的菌落形態，該菌株為乳白色圓形，表面不光滑，著生菌絲。增殖后菌株由乳白色轉變為紅褐色且有菌絲分布于培養基中。該菌屬于真菌界，菌株Z-5在光學顯微鏡下的形態如圖1所示，帚狀枝雙輪生，?；枯?～5個；瓶梗每輪4～6個；分生孢子橢圓形，經常呈長鏈狀。

圖1 菌株Z-5在光學顯微鏡下的形態Fig.1 Morphology of strain Z-5 under optical microscope

2.2 菌株的分子鑒定

PCR擴增菌株Z-5的ITS序列在NCBI（http：//archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/）網站上進行序列比對，用MEGA 5.0做分子發育樹。結果表明，菌株Z-5與褐紅籃狀真菌（Talaromyces pinophilusKF572452.1）的同源性最高，相似性達到99%，因此初步判斷Z-5屬于褐紅籃狀菌（圖2）。

圖2 菌株Z-5的ITS基因序列系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of ITS gene sequence of Z-5 species

2.3 菌株Z-5降解氨氮能力

2.3.1 接種量對菌株Z-5氨氮降解的影響 由圖3可知，當氨氮初始濃度為100 mg·L-1時，在不同的接種量條件下，氨氮降解率均隨著時間的增加呈現先快速增加后逐漸平穩的趨勢，同時隨著接種量的增加氨氮降解率大體呈先增加后減少的趨勢，第1、2 d時，隨著接種量的增加氨氮降解率呈逐漸增加趨勢，第3 d開始接種量1.0%時氨氮降解率升高，并在第5 d時達到峰值，為95.1%。其中接種量為0.1%、0.5%、1.5%、2.0%時均在培養第5 d氨氮降解率達到峰值，分別為79.2%、86.5%、87.8%、81.1%。以上結果表明，菌株Z-5最適的接種量為1%。

圖3 接種量對菌株Z-5氨氮降解率的影響Fig.3 Effects of inoculation amount on ammonia degradation rate of Z-5

2.3.2 初始氨氮濃度對菌株Z-5降解氨氮的影響由圖4可知，在初始氨氮濃度為100 mg·L-1時，培養2 d氨氮去除率即可達到90%以上，初始氨氮濃度為250、500、750 mg·L-1時，氨氮去除率分別在第3、4、7 d達到90%以上，而當氨氮初始濃度為1 000 mg·L-1時，在培養到第7 d時，氨氮去除率達到69.3%。結果表明，氨氮初始濃度越小，氨氮去除率達到最大所需的時間越短，當氨氮初始濃度為100 mg·L-1時，氨氮去除率于第4 d時達到最高，為96.1%。如圖5所示，氨氮初始濃度分別為100、250、500、750、1 000 mg·L-1時，其對應氨氮絕對降解量分別在第2、3、5、7 d時達到最高，分別為96.1、238.2、472.6、702.0、693.1 mg。以上結果說明，氨氮初始濃度越低，氨氮絕對降解量達到最大所需時間越短；初始氨氮濃度在100～750 mg·L-1的范圍內時，氨氮初始濃度越高，氨氮絕對降解量的峰值越高，但當氨氮初始濃度提高到1 000 mg·L-1時，其最大氨氮絕對降解量開始下降，因此，菌株Z-5在初始氨氮濃度1 000 mg·L-1以下時，提高氨氮濃度可以提高菌株Z-5的氨氮降解效率。

圖4 氨氮初始濃度對菌株Z-5氨氮降解率的影響Fig.4 Effect of initial concentration of ammonia nitrogen on ammonia degradation rate of Z-5

圖5 氨氮初始濃度對菌株Z-5氨氮絕對降解量的影響Fig.5 Effect of initial ammonia nitrogen concentration on absolute degradation of ammonia nitrogen by strain Z-5

2.3.3 碳源對菌株Z-5氨氮降解的影響 由圖6可知，菌株Z-5最適碳源為紅糖，在培養2 d內就可以將氨氮基本完全降解；其次為蔗糖和葡萄糖，在培養3 d后氨氮幾乎被完全降解；淀粉作為碳源氨氮降解效果最差，在培養第3 d時氨氮僅去除28.5%。以上結果表明，碳源是微生物生長的能源物質，對微生物的生長發育具有重要作用，合適的碳源不僅能提高氨氮的降解效果，而且能大大降低成本。

圖6 碳源對Z-5菌株氨氮濃度的影響Fig.6 Effect of carbon source on ammonia concentration of Z-5

2.3.4 pH對菌株Z-5氨氮降解的影響由圖7可知，在不同pH條件下，隨著培養時間的增加，氨氮去除率呈先上升后趨于平穩的趨勢。菌株在pH 6.0～8.0時均能很好地發揮脫氮作用，在第4天時其去除率分別為94.97%、94.91%、94.75%，其中當初始pH為8.0時其氨氮去除率在第3天時已達到90.66%，以上結果表明，該菌株更適合中性偏堿的環境，但是在弱酸環境時仍然具有較好的降解效果。

圖7 pH對Z-5菌株氨氮降解率的影響Fig.7 Effect of pH on ammonia degradation rate of Z-5

2.4 單因素交叉響應

上述每個單因素指標的計算結果具有片面性，無法表現多種因素的相互影響。為探索多因素的相互影響，用磷酸鹽緩沖液和HCl或NaOH調節不同酸堿度和氨氮初始濃度之間的相互影響為例，分析雙因素對氨氮降解率的影響，其交互作用的響應面如圖8所示，菌株Z-5的初始pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和初始氨氮濃度（100、250、500、750、1000 mg·L-1）的二元分布共包含5×5＝25組結構組合，從圖中可以看出，隨著pH的增加，不同初始氨氮濃度對應的氨氮降解率均先增加，到達最大值后再依次減??；隨著初始氨氮濃度的增加，不同pH對應的氨氮降解率均依次減小，并且當初始氨氮濃度為100 mg·L-1和pH為7.0時，其氨氮降解率最高，達到了96.3%，與探究單因素菌株Z-5降解氨氮效果的結果一致。綜合單因素的實驗結果分析，影響氨氮降解的幾個因素主要是氨氮初始濃度、碳源以及pH，故以氨氮降解率為指標，做初始濃度、碳源和pH 3因素3水平正交試驗L9（33），正交試驗結果見表2。由表2可知，各因素對氨氮降解率的影響主次順序分別為：氨氮初始濃度、碳源、pH，最優水平為A1B3C3，即氨氮初始濃度為100 mg·L-1，碳源為紅糖，pH為7.0，氨氮降解率達到了94.75%。

圖8 pH和氨氮初始濃度之間的二元分布Fig.8 Bivariate distribution of pH and initial concentration of ammonia nitrogen

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experiments

3 討論

研究表明，含有高濃度氨氮的廢水如果不經處理直接排放到水庫或江河湖海中，會影響人類健康，并且過量的氨氮會破壞水體自凈能力，打亂水體環境生態平衡［20］。本研究結果表明，菌株Z-5最適接種量為1.0%，分析原因為，接種量的大小決定了菌種的繁殖速度，接種量過大或過小，都會影響氨氮降解效果。接種量過大會造成溶氧不足，影響產物的合成，隨之產生更多的代謝中間產物，不利于菌株生長；過小會延長培養時間，影響氨氮降解速率。吳建江等［21］篩選出一株假單胞菌（Pseudomonassp.）XS76，其最適接種量為4%；王田野等［22］篩選出的一株異養硝化好氧反硝化菌不動桿菌（Acinetobactersp.）SQ2，研究發現其最適接種量為5%。適宜的氨氮濃度可以促進氨氧化菌的生長，提高氨氮去除效率，但過高的氨氮，會抑制氨氧化菌的生長與活性，從而影響其氨氮降解能力［16］。，隨著氨氮濃度的增加，菌株Z-5對污水氨氮去除率逐漸下降，在初始氨氮濃度100～750 mg·L-1的范圍內，菌株Z-5對氨氮的絕對去除量逐漸增加。分析原因為，氨氮濃度的提高可能會導致C/N比下降造成的；菌株Z-5的最適碳源為紅糖，不同的碳源對菌株的氨氮降解能力不同，本研究的碳源分別是葡萄糖、蔗糖、紅糖和淀粉，其中葡萄糖、蔗糖和淀粉均屬于化合物，而紅糖為混合物，總糖分≥85%，含有較多微量元素，如鐵、鋅、錳、鉻等，這些微量元素為菌株降解氨氮的過程中提供了營養物質；菌株Z-5最適pH為7.0，即在中性條件下氨氮降解能力最強。有研究表明，香茅醇假單胞菌（Pseudomonas）WXP-4［9］和寡養不動桿菌（Acinetobactersp.）SYF26［23］pH為7.0時脫氮能力最佳，而喻其林等［24］、朱偉等［25］在雞糞和生活污水中分離的微生物最適pH分別為7.5、8.0，表明微生物生存環境不同，篩選出的菌種最適pH也存在明顯的差異。

本研究對篩選菌株Z-5氨氮降解特性作了初步單因素分析、二元分布以及3因素3水平正交試驗，結果表明，當接種量為1%、氨氮初始濃度為100 mg·L-1、碳源為紅糖以及pH為7.0時，氨氮降解率最高，達到了94.75%。綜上所述，菌株Z-5對低濃度的氨氮具有較高的去除能力，在培養時長足夠的條件下對高氨氮廢水也具有較強的去除能力，本研究結果為菌株Z-5在實際廢水處理中的應用奠定了理論基礎，但其他環境影響因素以及多因素交叉影響情況有待進一步分析。