外泌體lncRNA H19在miR-7/KLF4/VEGF調控人肺腺癌細胞遷移和侵襲中的作用研究

王林 易基群 江高峰

【摘要】目的 探討外泌體長鏈非編碼RNA H19（lncRNA H19）調控人肺腺癌細胞遷移和侵襲作用及機制。方法 收集確診肺腺癌并經影像學診斷已發生遠處轉移患者（轉移組）或無遠處轉移患者（非轉移組）以及正常人群（正常對照組）各30例外周血標本，分離單核細胞獲得血漿上清液分離外泌體，同時取培養人肺腺癌細胞系A549細胞時收集的培養上清液分離外泌體，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測并比較組間外泌體lncRNA H19 mRNA表達差異。并采用慢病毒介導的lncRNA H19特異性小干擾RNA（shRNA）構建穩定敲低lncRNA H19的人肺腺癌A549細胞模型，熒光素酶驗證lncRNA H19通過吸附結合微RNA-7（miR-7），劃痕實驗、Transwell實驗檢測穩定敲低lncRNA H19對A549細胞遷移、侵襲能力的影響，蛋白免疫印跡法檢測穩定敲低lncRNA H19對miR-7及其下游的信號通路蛋白Kruppel樣因子4（KLF4）和血管內皮生長因子（VEGF）蛋白表達水平的影響。結果 外泌體被成功分離。與非轉移組肺腺癌患者相比，轉移組肺腺癌患者外周血外泌體lncRNA H19 mRNA表達增加（P < 0.01）。A549細胞中，與對照細胞相比，穩定敲低lncRNA H19細胞的外泌體lncRNA H19 mRNA表達減少（P 0.05）。A549細胞中，穩定敲低lncRNA H19后KLF4和VEGF蛋白表達水平均有所下調（P均< 0.05）。結論 外泌體lncRNA H19可能在肺腺癌細胞遷移和侵襲過程中發揮作用，且這種作用可能與競爭性結合miR-7及KLF4/VEGF信號通路有關。

【關鍵詞】長鏈非編碼核糖核酸H19;微核糖核酸-7;侵襲;遷移

Regulatory effect of exosomes lncRNA H19 on migration and invasion of human lung adenocarcinoma cells through miR-7/KLF4/VEGF signaling pathway Wang Lin， Yi Jiqun， Jiang Gaofeng. Department of Oncology， Guangzhou Red Cross Hospital， Medical College of Jinan University， Guangzhou 510220， China

Corresponding author， Wang Lin， E-mail： Wanglin476@ext.jnu.edu.cn

【Abstract】Objective To investigate the effect and mechanism of exosomes long non-coding RNA H19 （lncRNA H19） on the migration and invasion of human lung adenocarcinoma cells. Methods Peripheral blood samples were collected from 30 lung adenocarcinoma patients with distant metastasis （metastasis group）， 30 patients without distant metastasis （non-metastasis group） and 30 healthy controls （normal control group）. The exosomes were isolated from plasma supernatant obtained from separating monocytes， and the exosomes were separated from culture supernatant collected from human lung adenocarcinoma cell line A549. The expression levels of exosomes lncRNA H19 mRNA were detected and compared among three groups by real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR）. A549 cell models with stable H19 knockdown were constructed by lentivirus-mediated H19 shRNA. The binding between lncRNA H19 and microRNA-7 （miR-7） was verified by luciferase assay. The effect of stable lncRNA H19 knockdown upon the migration and invasion of A549 cells was evaluated by wound healing test and Transwell chamber test. The effect of stable lncRNA H19 knockdown upon the expression levels of KLF4 and VEGF proteins was assessed by Western blot. Results The exosomes were successfully isolated. Compared with the non-metastasis group， the expression level of lncRNA H19 mRNA in the peripheral blood exosomes in the metastasis group was significantly up-regulated （P < 0.01）. Compared with the control cells， the expression level of lncRNA H19 mRNA in the exosomes of A549 cells with stable lncRNA H19 knockdown was significantly down-regulated （P < 0.01）. Wound healing test and Transwell chamber test demonstrated that the migration and invasion of A549 cells were significantly decreased after lncRNA H19 knockdown. The fluorescent intensity of A549 cells was significantly decreased after wild-type lncRNA H19 was co-transfected with miR-7 （P < 0.01）， whereas the fluorescent intensity of A549 cells did not significantly change after the co-transfection of mutant lncRNA H19 and miR-7 （P >

0.05）. The expression levels of KLF4 and VEGF in the A549 cells were significantly down-regulated after stable lncRNA H19 knockdown （both P < 0.05）. Conclusion Exosomes lncRNA H19 may play a role in the migration and invasion of lung adenocarcinoma cells， which is probably correlated with the competitive binding with miR-7 and the miR-7/KLF4/VEGF signaling pathway.

【Key words】Long non-coding RNA H19; MicroRNA-7; Invasion; Metastasis

非小細胞肺癌（NSCLC）約占所有肺癌的80%，肺腺癌屬于NSCLC。癌細胞遷移被認為腫瘤晚期的主要特征[1]。因此，對肺腺癌細胞侵襲機制的更好理解將有助于開發更多的治療策略。外泌體的作用被認為是傳遞細胞間信號交流，腫瘤細胞分泌外泌體中攜帶大量致癌成分可以刺激腫瘤細胞遷移的發生發展[2]。研究表明，腫瘤外泌體可以通過改變腫瘤微環境、上皮細胞-間充質轉化（EMT）和腫瘤微血管生成等多方面促進腫瘤進程[3-4]。近年來針對外泌體中長鏈非編碼RNA（lncRNA）的作用越來越受到重視。LncRNA H19在不同癌種類型和細胞背景中發揮的作用也不盡相同[5-6]。到目前為止，lncRNA H19在肺癌細胞遷移和侵襲中的作用仍然不盡為人所知。一般認為，lncRNA在細胞中發揮“分子海綿”的作用，可大量吸附并抑制微RNA（miR）對靶基因的作用。前期研究顯示，lncRNA H19可以通過吸附miR-7，并參與調控腫瘤微環境和血管異?；?，影響腫瘤轉移前微環境形成[7-8]。腫瘤的轉移和生長主要依賴新生血管的形成。然而，目前關于lncRNA H19參與肺癌侵襲遷移的機制鮮有報道。本研究探討外泌體lncRNA H19與miR-7的關系以及其在肺腺癌遷移侵襲中的作用及機制，現報告如下。

材料與方法

一、實驗試劑

主要有RPMI-1640培養基（美國Gibco），胎牛血清（美國Gibco），外泌體提取試劑盒（德國Qiagen），Lipo3000轉染試劑盒（美國Life），TRIzol總RNA抽提試劑（美國Life），逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa），實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒（日本TaKaRa），雙熒光素酶報告基因試劑盒（美國Promega），GM130抗體（美國Affnity），CD63抗體（美國Affinity），Kruppel樣因子4（KLF4）抗體（美國Affinity），血管內皮生長因子（VEGF）抗體（美國Affinity），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（美國CST），HRP-山羊抗兔二抗（博奧龍）。本研究所使用的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

二、細胞培養

人肺腺癌細胞系A549細胞（南部戰區總醫院腫瘤科張為民教授惠贈）用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養，每48 h更換培養液1次。培養瓶中的細胞生長到80% ～ 95% 融合時進行細胞傳代或收集細胞鋪板培養。

三、外泌體分離及鑒定

收集廣州市紅十字會醫院確診肺腺癌并經影像學診斷已發生遠處轉移患者（轉移組）或無遠處轉移患者（非轉移組）以及正常人群（正常對照組）各30例外周血標本。本研究經廣州市紅十字會醫院醫學研究倫理委員會批準（批件號2019-146-01），入組患者均已簽署知情同意書。取患者外周血標本分離單核細胞獲得血漿上清液，同時取培養A549細胞時收集的培養上清液，具體步驟按照試劑盒說明書執行。將提取外泌體按要求稀釋至100 μg/100 μL。利用透射電鏡對外泌體進行形態學鑒定，利用蛋白免疫印跡法分析外泌體的CD63和GM-130表達情況。

四、qRT-PCR

根據TRIzol試劑盒說明書從外泌體中提取總RNA。進行qRT-PCR測定以評估lncRNA H19 mRNA的表達，引物設計如下：lncRNA H19正向5-ATCGGTGCCTCAGCGTTCGG-3、反向5-C

TGTCCTCGCCGTCACACCG-3，GAPDH正向5-C

AAGAGCACAAGAGGAAGAGAG-3、反向5-CTA

CATGGCAACTGTGAGGAG-3。通過公式計算Ct值，具體為Ct = CtlncRNA H19-CtGAPDH，將lncRNA H19 mRNA表達水平標準化，每組設3個復孔，實驗獨立重復3次。

五、LncRNA H19 shRNA慢病毒的構建

將含有綠色熒光蛋白（GFP）報告基因的慢病毒載體LV-008（永諾生物）用于表達靶向lncRNA H19（5-CCAACATCAAAGACACCAT-3）和干擾對照（5-TGGTTTACATGTCGACTAA-3）序列的短發夾RNA（shRNA）。用包裝載體將LV-008-shH19質粒轉染到人胚腎細胞HEK 293T細胞（南部戰區總醫院腫瘤科張為民教授惠贈）中。轉染72 h收集含有感染慢病毒的上清液，100 000×g超速離心2 h濃縮慢病毒，并重懸于磷酸鹽緩沖液中。將A549細胞接種在24孔板中，并在5 ～ 10 μg/mL聚凝胺存在下用慢病毒感染，后用2 μg/mL嘌呤霉素篩選lncRNA H19敲低細胞10 ～ 15 d。

六、雙熒光素酶報告基因檢測

利用在線數據庫RNAhybrid （https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/）預測分析結合位點結果（圖5A），設計PCR引物，正向5-CAGGGACATGGCAGGGGACACAGGACAG-3，反向5-CGCCAGGTCCGGTGGACGTGACAAGCAGG-3。PCR產物經純化回收后，連接到雙熒光素酶報告基因pmirGLO質粒中，在野生型載體基礎上，將結合位點GGCGGCGAG突變為CCGCCGCTC，并構建突變型載體。野生型和突變型分別命名為：pmirGLO-H19-WT和pmirGLO-H19-MUT，將各構建載體與miR-7共轉染293T細胞。采用美國 Promega公司的雙熒光素酶報告基因檢測系統，依據實驗說明進行操作，計算螢火蟲熒光素酶值與海腎熒光值的比值反應熒光素酶活性。每組設3個復孔，實驗獨立重復3次。

七、劃痕實驗及Transwell實驗

分離提取野生型或穩定干擾lncRNA H19的A549細胞外泌體，用其處理A549細胞12 h后，消化細胞，取對數生長期細胞，接種于6孔板，每孔約5×105個，待細胞達90%以上融合時，使用200 μL微量槍頭均勻筆直劃出劃痕進行劃痕實驗。更換無血清培養液2 mL，置于37 ℃、5%CO2培養箱培養，于12、24 h倒置顯微鏡下拍照。將50 μL濃度為10%的Matrigel鋪于Transwell小室底部，將外泌體處理后的A549細胞加入Transwell小室中，下室加入600 ?L含10%胎牛血清的完全培養基，置于培養箱中培養24 h。棄Transwell小室培養基，磷酸鹽緩沖液洗3次，使用冰甲醇固定15 min，0.1%結晶紫溶液染色20 min，取出Transwell小室，用棉簽擦去上室內的細胞和基質膠，顯微鏡下觀察Transwell小室底部下室側附著的細胞。每組設3個復孔，實驗獨立重復3次。

八、蛋白免疫印跡法分析

用磷酸鹽緩沖液洗滌后，將細胞重新懸浮并加入裂解液（50 mmol/L Tris緩沖液，100 mmol/LNaCl，1%NP-40裂解液和0.5%脫氧膽酸鹽，1 mmol/L苯甲基磺?；? ℃中裂解20 min。然后通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉到聚二氟乙烯膜（德國Millipore）上。將膜在含有5%（質量/體積）脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST，含0.05%吐溫20）封閉1 h，并與第一抗體（1∶1000）一起孵育2 h，然后洗滌3 h。用TBST洗滌3次，每次10 min，然后與二抗（1∶5000）孵育1 h。后用TBST洗滌3次，每次10 min，通過增強化學發光法（ECL， 瑞典Amersham Pharmacia Biotech）顯色后化學發光成像系統成像，Band Scan圖像分析軟件進行積分光密度值分析。每組設3個復孔，實驗獨立重復3次。

九、統計學處理

使用SPSS 18.0進行分析，正態分布計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、外泌體提取鑒定

透射電子顯微鏡下外泌體為直徑40 ～ 100 nm的圓形囊泡樣結構，見圖1A。蛋白免疫印跡法檢測外泌體跨膜標記分子GM130（高爾基體表面相關的分子，不會隨囊泡轉運至外泌體）與外泌體表面標記分子CD63的表達顯示：與細胞裂解液相比，外泌體高表達CD63，低表達GM-130，見圖1B。以上結果顯示，外泌體被成功分離。

二、轉移組、非轉移組肺腺癌患者和正常對照組患者外周血外泌體lncRNA H19 mRNA表達情況

因lncRNA H19表達差異在腫瘤發生發展已明確，且本文重點研究其在腫瘤轉移過程中作用，故后續分析僅在轉移組與未發生轉移組之間進行比較，結果顯示與非轉移組肺腺癌患者相比，轉移組肺腺癌患者外周血外泌體中lncRNA H19 mRNA表達增加（t = 2.776，P < 0.01），提示lncRNA H19高表達可能與肺腺癌轉移密切相關，見圖2。

三、穩定敲低lncRNA H19的A549細胞構建

A549細胞中，與對照細胞相比，穩定敲低lncRNA H19細胞的外泌體中lncRNA H19 mRNA表達量減少約65%（t = 4.912，P < 0.01），見圖3。

四、穩定敲低lncRNA H19對A549細胞遷移和侵襲能力的影響

細胞劃痕實驗和Transwell實驗顯示敲低lncRNA H19的A549細胞遷移和侵襲的能力下降，見圖4。

五、雙熒光素酶報告基因驗證lncRNA H19和miR-7相互結合

在線數據庫RNAhybrid預測結合位點結果見圖5A。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，野生型 lncRNA H19 與 miR-7共轉染后A549細胞熒光素酶相對活性下降（t = 5.347，P < 0.001），然而突變型lncRNA H19與miR共轉染后A549細胞后熒光素酶相對活性未見明顯變化（t = 0.676，P = 0.536），表明 lncRNA H19 與 miR-7之間存在特異性結合，見圖5B。

六、敲除外泌體H19導致下游信號蛋白的變化

A549細胞中，穩定敲低lncRNA H19后KLF4 （t = 4.614，P < 0.01）和VEGF（t = 3.976， P < 0.05）蛋白表達水平均有所下調，見圖6。

討論

轉移是肺癌治療領域的重要挑戰，更好地了解腫瘤轉移的分子機制可能會發現更有效的治療策略。外泌體作為細胞交流的信號傳遞者，含有大量的lncRNA，在細胞中起到miR分子的“海綿吸附”作用，從而解除miR對靶基因的抑制作用[7-9]。

本研究顯示，臨床中發生轉移的肺腺癌患者血清中外泌體lncRNA H19 mRNA表達比未發生轉移的肺腺癌患者明顯升高，這表明外泌體源性lncRNA H19與肺癌發生轉移有密切關系。進一步的研究表明，外泌體中包含lncRNA H19，通過競爭性內源RNA方式吸附miR-7的表達，從而解除miR-7對KLF4的翻譯抑制，并激活KLF4/VEGF信號通路進而參與調控細胞遷移和侵襲。

外泌體被認為是造成原發性腫瘤微環境改變的重要通訊介質[10-13]。外泌體是粒徑為30 ～ 150 nm的小囊泡。這些小囊泡通過胞吐方式被釋放到細胞外環境中并造成受體細胞相關表型改變[14-15]。因此，外泌體作為細胞間通訊的有效介質，在腫瘤發生中具有關鍵作用。多項研究顯示腫瘤細胞分泌外泌體增多，且易于從血液中分離。細胞外泌體是近年來發現的一類細胞間信號傳遞的關鍵媒介，這種由細胞主動分泌的微小囊泡，可將細胞內大量信息物質打包，由一個細胞傳遞至另一個細胞，從而對靶細胞的性質進行跨細胞調控[16]。腫瘤細胞來源的外泌體通過轉運具有生物功能的相關分子如蛋白質、miR和lncRNA等來調節靶細胞[17-20]。本研究中，穩定敲低表達外泌體lncRNA H19的A549細胞后，其遷移和侵襲能力下降。

LncRNA和miR的作用方式很多，其中之一就是lncRNA可以作為一種競爭性內源性RNA與miR相互作用，即所謂海綿吸附作用，參與靶基因的表達調控[20-21]。本研究顯示，外泌體lncRNA H19通過競爭性結合miR-7，而miR-7能夠通過靶向KLF4基因，KLF4是VEGF的轉錄激活因子[22-23]。穩定敲低外泌體lncRNA H19能夠顯著影響KLF4和VEGF的mRNA和蛋白表達水平，并抑制腫瘤細胞遷移和侵襲。

綜上所述，肺癌細胞分泌的外泌體中含有lncRNA H19，它通過競爭性吸附miR-7，從而解除miR-7對KLF4的翻譯抑制，并激活KLF4/VEGF信號通路進而參與調控細胞遷移和侵襲，敲低外泌體lncRNA H19可抑制肺腺癌細胞的遷移和侵襲。lncRNA H19可能在肺腺癌發展中起重要作用，可考慮作為轉移性肺腺癌診斷和治療研究的潛在靶點。值得注意的是，本研究僅涉及單一腫瘤細胞，其他不同肺癌細胞尤其是不同侵襲能力的肺癌細胞中有待進一步加以證實，且外泌體lncRNA H19參與肺癌侵襲轉移是否存在其他作用機制仍需后續實驗加以驗證。

參 考 文 獻

[1] Herbst R S， Morgensztern D， Boshoff C. The biology and management of non-small cell lung cancer. Nature， 2018， 553（7689）：446-454.

[2] 成林杰， 郭海， 姚巧玲. 外泌體在非小細胞肺癌中的研究進展. 新醫學，2021，52（1）：5-9.

[3] Estrella Ibarra P， García-Solís P， Solís-Sáinz J C， Cruz-Hernández A. Expression of miRNA in obesity and insulin resistance： a review. Endokrynol Pol， 2021，72（1）：73-80.

[4] Chen X， Liang H， Zhang J， Zen K， Zhang C Y. Horizontal transfer of microRNAs： molecular mechanisms and clinical applications. Protein Cell， 2012， 3（1）：28-37.

[5] Shi X， Sun M， Liu H， Yao Y， Song Y. Long non-coding RNAs： a new frontier in the study of human diseases. Cancer Lett， 2013， 339（2）：159-166.

[6] Jiang X， Yan Y， Hu M， Chen X， Wang Y， Dai Y， Wu D， Wang Y， Zhuang Z， Xia H. Increased level of H19 long noncoding RNA promotes invasion， angiogenesis， and stemness of glioblastoma cells. J Neurosurg， 2016， 2016（1）：129-136.

[7] Ell B， Mercatali L， Ibrahim T， Campbell N， Schwarzenbach H， Pantel K， Amadori D， Kang Y. Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bone metastasis. Cancer Cell， 2013， 24（4）：542-556.

[8] Wortzel I， Dror S， Kenific C M， Lyden D. Exosome-mediated metastasis： communication from a distance. Dev Cell， 2019， 49（3）：347-360.

[9] Zhou W， Fong M Y， Min Y， Somlo G， Liu L， Palomares M R， Yu Y， Chow A， OConnor S T， Chin A R， Yen Y， Wang Y， Marcusson E G， Chu P， Wu J， Wu X， Li A X， Li Z， Gao H， Ren X， Boldin M P， Lin P C， Wang S E. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell， 2014， 25（4）：501-515.

[10] Chin A R， Wang S E. Cancer tills the premetastatic field： mechanistic basis and clinical implications. Clin Cancer Res， 2016， 22（15）：3725-3733.

[11] Sleeman J P. The metastatic niche and stromal progression. Cancer Metastasis Rev， 2012， 31（3-4）：429-440.

[12] Liu Y， Cao X. Characteristics and significance of the pre-metastatic Niche. Cancer Cell， 2016， 30（5）：668-681.

[13] Chafe S C， Lou Y， Sceneay J， Vallejo M， Hamilton M J， McDonald P C， Bennewith K L， M?ller A， Dedhar S. Carbonic

anhydrase Ⅸ promotes myeloid-derived suppressor cell

mobilization and establishment of a metastatic niche by stimulating G-CSF production. Cancer Res， 2015， 75（6）：996-1008.

[14] Pathania A S， Challagundla K B. Exosomal long non-coding RNAs： emerging players in the tumor microenvironment. Mol Ther Nucleic Acids， 2020， 23：1371-1383.

[15] Zhang W， Zhang C， Li W， Deng J， Herrmann A， Priceman S J， Liang W， Shen S， Pal S K， Hoon D S B， Yu H. CD8+ T-cell immunosurveillance constrains lymphoid premetastatic myeloid cell accumulation. Eur J Immunol， 2015， 45（1）：71-81.

[16] Melo S A， Luecke L B， Kahlert C， Fernandez A F， Gammon S T， Kaye J， LeBleu V S， Mittendorf E A， Weitz J， Rahbari N， Reissfelder C， Pilarsky C， Fraga M F， Piwnica-Worms D， Kalluri R. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature， 2015， 523（7559）：177-182.

[17] Gabory A， Ripoche M A， Yoshimizu T， Dandolo L. The H19 gene： regulation and function of a non-coding RNA. Cytogenet Genome Res， 2006， 113（1-4）：188-193.

[18] Shi X， Sun M， Liu H， Yao Y， Song Y. Long non-coding RNAs： a new frontier in the study of human diseases. Cancer Lett， 2013， 339（2）：159-166.

[19] Jiang X， Yan Y， Hu M， Chen X， Wang Y， Dai Y， Wu D， Wang Y， Zhuang Z， Xia H. Increased level of H19 long noncoding RNA promotes invasion， angiogenesis， and stemness of glioblastoma cells. J Neurosurg， 2016， 2016（1）：129-136.

[20] Keniry A， Oxley D， Monnier P， Kyba M， Dandolo L， Smits G， Reik W. The H19 lincRNA is a developmental reservoir of miR-675 that suppresses growth and Igf1r. Nat Cell Biol， 2012， 14（7）：659-665.

[21] Jia P， Cai H， Liu X， Chen J， Ma J， Wang P， Liu Y， Zheng J， Xue Y. Long non-coding RNA H19 regulates glioma angiogenesis and the biological behavior of glioma-associated endothelial cells by inhibiting microRNA-29a. Cancer Lett， 2016， 381（2）：359-369.

[22] Huang H， Wei L， Qin T， Yang N， Li Z， Xu Z. Circular RNA ciRS-7 triggers the migration and invasion of esophageal squamous cell carcinoma via miR-7/KLF4 and NF-κB signals. Cancer Biol Ther， 2019， 20（1）：73-80.

[23] Li Y Z， Wen L， Wei X， Wang Q R， Xu L W， Zhang H M， Liu W C. Inhibition of miR-7 promotes angiogenesis in human umbilical vein endothelial cells by upregulating VEGF via KLF4. Oncol Rep， 2016， 36（3）：1569-1575.

（收稿日期：2021-04-20）

（本文編輯：林燕薇）