不同輻照儀對大鼠下頜骨放射性頜骨壞死模型建立的影響

陳滑維 張圣福 何海濤

陸軍軍醫大學大坪醫院口腔科，重慶400042

隨著放療在頭頸癌的應用日趨普及，放射性頜骨壞死（osteoradionecrosis of jaw，ORNJ）逐漸增多，發病率可高達35%[1]，臨床表現為疼痛、張口受限、咀嚼或言語障礙、難治性瘺道形成，甚至病理性骨折。ORNJ的發病機制不清，防治困難[2-5]。發病機制相關學說主要有：放射-創傷-感染學說、低氧低血供低細胞學說、纖維性變學說[6-8]，各學說既相互補充又相互矛盾。這可能與目前尚無成熟、統一的ORNJ動物模型建立方法有關，輻照儀器、照射能量、劑量率不同，照射方法及劑量選擇差異等，都不可避免地會影響實驗結果?，F有ORNJ動物模型建立使用的輻照儀主要有內照射器、直線加速器和小動物輻照儀等[9-11]，但不同輻照儀對ORNJ建模的影響鮮見報道。本研究比較直線加速器和小動物輻照儀在不同劑量下對ORNJ建模的影響，探索理想的ORNJ建模方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

由陸軍軍醫大學大坪醫院實驗動物中心[許可證號SCXK（渝）2017-0006]提供SPF級成年雄性SD大鼠33只，鼠齡12周，體重250 g±20 g，于獨立通風籠盒標準實驗動物房飼養，自由進食水。適應性喂養1周后，將SD大鼠隨機分為CN組（空白對照組，3只）、A組（15只）和B組（15只）。A、B組又各隨機分為3個小組：A35、A40、A45組和B35、B40、B45組，每組各5只大鼠。

1.2 輻照

用1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射（5 mL·kg-1）麻醉，大鼠右側臥位固定，鉛板遮擋保護，暴露左側下頜骨磨牙區約2 cm×2 cm照射范圍。

CN組只麻醉無照射。A組用直線加速器輻照儀（Elekta Synergy，Elekta公司，瑞典）照射，能量類型X-Ray，能量8 MV，劑量率600 MU·min-1，照射方式為體外照射。B組采用小動物輻照儀（RS-2000，Rad Source公司，美國）照射，能量類型X-Ray，能量160 kV，劑量率1.265 Gy·min-1，照射方式為體外照射。A35/B35、A40/B40、A45/B45組分別接受35、40、45 Gy的照射總劑量，以每天7、8、9 Gy連續5 d分割照射的方法照射。

1.3 照射區拔牙

照射結束后1周，觀察照射區域黏膜損傷情況，并由同一術者拔除所有大鼠左側下頜骨照射區中的3顆磨牙，形成拔牙創傷。

1.4 大體觀察及取材

每周觀察大鼠照射局部及全身情況、門齒咬合關系、記錄體重。拔牙后3周安樂處死所有大鼠，獲取左側下頜骨標本，觀察拔牙創牙齦和牙槽窩愈合情況，固定于4%多聚甲醛。

1.5 micro-CT掃描及重建

采用micro-CT（μCT 100，SCANCO公司，美國）掃描，掃描參數：70 kV，114μA，20μm分辨率，20μm層距。采用Inveon Research Workplace軟件三維重建，對照射區域牙槽骨及間隔骨質進行分析，感興趣區域選定為下頜磨牙拔牙創區域。

1.6 組織病理學觀察

掃描后的標本經脫水、包埋、切片后行蘇木精-伊紅（hemotoxylin and eosin，HE）染色。顯微鏡下觀察，在400倍下每個樣本選擇6張鏡下照片，由3個觀察者進行空白骨陷窩及骨陷窩內骨細胞計數，評估下頜骨損傷情況，空白骨陷窩率（%）=空白骨陷窩數量/骨組織細胞總數×100%，骨細胞率（%）=骨細胞數/骨組織細胞總數×100%。

1.7 建模成功評估

根據ORNJ的評定標準（輻射史，骨暴露，放射性骨破壞證據，無腫瘤復發，病理可見死骨形成[12-13]），評估模型建立是否成功，并計算各組建模成功率，建模成功率（%）=每組大鼠建模成功數量（只）/每組大鼠總數（只）×100%。

1.8 統計分析

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，組間比較采用完全隨機單因素方差分析。

2 結果

2.1 大體表現

照射后1周，A、B組大鼠局部皮膚均出現紅腫、脫毛，口腔黏膜潰爛（圖1），A組照射區變化不顯著，主要累及頸前區域，B組累及照射區域；與B組相比，A組大鼠精神狀態、全身情況更差，全身毛發更粗糙，體重下降更明顯。

圖1 大鼠照射后1周大體觀察情況Fig 1 Macroscopic change of rat after 1 week radiation

拔牙后3周，3組大鼠體重均逐漸增加，增幅A組＜B組＜CN組（表1）；A45組頸前區域、B組照射區毛發稀疏、脫落，B45組可見皮膚破潰；A組雙側下頜骨生長受抑制，B組左側下頜骨受抑制，B40組見嚴重的咬合錯亂（圖2）；CN組、A35、A40組大鼠拔牙創牙齦愈合，A45、B組拔牙創未愈合、明顯骨外露（圖3）。

圖3 拔牙后3周拔牙創愈合情況Fig 3 Healing of extraction wound 3 weeks after tooth extraction

表1 各組大鼠不同時間的體重Tab 1 The weight in different radiation times of rat in every group kg

圖2 大鼠拔牙后3周大體表現Fig 2 Macroscopic change of rat 3 weeks after tooth extraction

2.2 micro-CT分析

micro-CT分析結果顯示，與CN組相比，A35組照射區牙槽骨及間隔骨質輕度缺損，A40、A45、B組照射區牙槽骨骨質缺損、破壞明顯，皮質骨骨量減少（圖4）。

圖4 拔牙區micro-CT影像學改變Fig 4 Micro-CT image change of the extraction area 3 weeks after tooth extraction

2.3 組織病理學觀察

HE染色顯示，隨照射劑量增加，A、B組大鼠下頜骨骨細胞、血管數量均減少，血管腔閉塞，殘留骨周圍破骨細胞數量增加，髓腔形態消失，大量炎癥細胞浸潤、纖維組織增生（圖5）。與CN組相比，A、B組空白骨陷窩率均增加（P＜0.05）。A組各亞組間均存在統計學差異（P＜0.05），A35組無死骨形成，A40、A45組可見明顯死骨。B組各亞組均可見明顯死骨形成，B35與B40、B45組間存在統計學差異，B40與B45組間無統計學差異。A35與B35、A40與B40組間骨細胞率、空白骨陷窩率具有統計學差異（圖6）。

圖5 照射后各組皮質骨及髓腔變化 HE ×100Fig 5 Changes of cortical bone and medullary cavity in each group after irradiation HE ×100

圖6 照射后各組骨細胞及空白骨陷窩變化Fig 6 Changes of bone cells and lacunae in each group after irradiation

2.4 建模成功率

A35、A40組大鼠在拔牙時各死亡1只，A45組拔牙時死亡2只，拔牙后3 d死亡1只，A組總存活率為66.7%（10/15）。B40組于照射第2天死亡1只，B組總存活率為93.3%（14/15）。根據ORNJ的標準，病理學上有死骨形成為建模成功的標志，A、B兩組的建模成功率分別為40%（6/15）、93.3%（14/15）。

3 討論

ORNJ是頭頸腫瘤放療中最嚴重的常見并發癥[1]，盡管放療技術及防治措施在不斷改善，但由于其發病機制不明，臨床防治困難，發病率仍無明顯下降[12,14]。ORNJ發病機制研究所用的建模方法差異較大，主要體現在照射儀器種類、照射方法、照射劑量等方面。輻照儀器不同，導致照射能量、劑量率相差較大，同時也會影響照射方法及輻照劑量的選擇，故輻照儀器成為了模型建立的關鍵因素。ORNJ建模儀器主要包括：單次高劑量近距離內照射、單次高劑量外照射、分割外照射和小動物輻照儀等[9-11,15-16]。內照射需要切開下頜骨表面皮膚，置入導管和放射粒子，屬于有創操作，動物死亡率高，同時增加局部炎性細胞因子釋放，影響下頜骨的微環境，并且近距離內照射很少用于頭頸癌的治療[17]。與之相比，外照射更符合臨床治療模式，對局部微環境影響較小。單次高劑量外照射由于急性不良反應嚴重、大鼠死亡率高、實驗成本高、臨床運用價值低等原因，亦非最佳的照射模式選擇。分割外照射是臨床放射治療的常用輻照方法，避免了單次大劑量照射的急性不良反應，符合正常細胞的生理變化。RS-2000因其在劑量均一性、安全性、穩定性、試驗重復性等方面的優勢，已成為生命科學研究領域中重要的X-Ray小動物輻照儀器[11]，但目前關于分割模式下直線加速器和小動物輻照儀對ORNJ模型建立是否存在差異鮮見報道。由于照射儀器隨著使用時限的延長，同一照射參數下所釋放的X線會有所衰減，若未及時矯正可導致試驗過程中動物實際接受的劑量不足，為了減少因儀器因素所致的混雜因素，本研究分別采用總劑量35、40、45 Gy進階式5次分割模式照射大鼠，探索理想的大鼠ORNJ建模方案。

目前ORNJ診斷的主要依據有：輻射史，骨暴露，放射性骨破壞證據，無腫瘤復發，病理可見死骨形成[12-13]。本研究從臨床表現、影像學及病理學進行評估，發現照射組照射區域急性皮膚黏膜反應，拔牙創愈合差、骨外露；micro-CT顯示拔牙創骨質破壞；病理可見骨組織骨量減少，髓腔空泡化，A40、A45和B組明顯死骨形成，符合典型ORNJ病理改變。但是，B組大鼠照射后局部急性黏膜不良反應、體重下降比A組輕，拔牙創骨暴露面積比A組嚴重。照射后A組雙側頜骨生長明顯受抑，B組局限于照射側。B組總存活率、建模成功率均優于A組，也高于其他文獻[18]報道的建模成功率（83%）。本實驗中加入了40、45 Gy高劑量照射，在總存活率稍低的情況下，模型成功率卻不低于文獻報道，表明小動物輻照儀照射后大鼠全身及局部情況較好，死亡率低，建模成功率高，更利于長期及動態觀察照射后病理變化。對比2種照射儀器，發現輻照劑量固定的情況下，照射能量及劑量率是主要的差異。直線加速器照射能量為8 MV，劑量率為600 MU·min-1；RS-2000輻照儀器能量為160 kV，劑量率為1.265 Gy·min-1。能量越高，劑量率越大，其組織穿透能力越強，照射深度越深、范圍越廣，急性不良反應就越重，因而A組大鼠全身及局部不良反應比B組更重，從而增加實驗的混雜因素，影響模型建立。此外，A35組肉眼可見拔牙創愈合，影像學上無明顯骨質破壞，染色見骨細胞數量降低，空白骨陷窩增多，但無明顯死骨形成，因此，直線加速器35 Gy照射后下頜骨改變更符合放射性骨損傷模型。A40組拔牙創愈合，A45組拔牙創明顯骨外露，micro-CT上有骨質破壞，病理可見明顯死骨形成。A40組的臨床表現不符合ORNJ診斷標準，但影像學及病理符合，與臨床實際情況存在差異，非最佳模型選擇。A45組滿足目前ORNJ診斷標準，但大鼠一般情況差，照射后不良反應重，動物死亡風險較高，亦非理想的模型選擇。B組照射后下頜骨改變不僅符合典型的ORNJ病理變化，而且試驗過程中大鼠一般情況更好，照射后急性炎癥反應較輕，大鼠死亡率低，病理變化顯著，模型成功率高，進一步驗證了小動物輻照儀在ORNJ建模中的優勢。同時，B35與B40、B45組間骨細胞、空白骨陷窩變化存在差異，B40與B45組間差異無統計學意義。研究[18-19]發現，35 Gy的照射總劑量對大鼠健康骨骼的組織病理學影響相當于人類輻照總劑量70 Gy，故小動物輻照儀35 Gy照射劑量最接近人體實際情況。

根據目前ORNJ的4種分型[3,20-21]，A35組模型也可能是B0S0無明顯癥狀期，屬于ORNJ早期病理變化，B組動物模型可能屬于中晚期病理改變。但若以治療纖維化疾病為標準，早期纖維化治療是臨床治療的關鍵時期，治療效果對疾病的愈后具有重要意義，然而現有能與臨床ORNJ分型相匹配的動物模型研究較少，尤其是早期ORNJ的認識及治療。本實驗以拔牙后3周為實驗終點，未動態描述下頜骨變化，今后尚需進一步延長觀察時間。

綜上，小動物輻照儀在35 Gy照射劑量下大鼠一般情況好、死亡率低、建模成功率高，簡單易行，是較理想的大鼠ORNJ建模方法。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。