西藏3份垂穗披堿草耐旱性評價

周 晶 孫 侃 周忠義 王傳旗 苗彥軍

（1深圳市北林苑景觀及建筑規劃設計院有限公司，518038，廣東深圳；2牙克石市草原工作站，022150，內蒙古牙克石；3西藏農牧學院，860000，西藏林芝）

西藏是我國西南邊陲重要的生態屏障，為披堿草屬（Elymus）牧草主要分布區之一。青藏高原自然環境嚴酷，寒冷干燥的氣候條件對牧草的生存、產量和品質都有很大影響[1]。藏北地區草畜矛盾突出，草地退化嚴重，而干旱是制約藏北高寒草原植被修復和人工草地建植的關鍵因素。因此，亟需培育出耐旱性強的鄉土植物品種。

垂穗披堿草（E.nutans）為禾本科披堿草屬多年生牧草和生態草，是西藏鄉土禾草植物中的優勢草種之一，對西藏高寒地區人工草地建植和天然草地植被修復具有重要意義。在旱區和缺水區，水分是影響植物生長發育的重要生態因子。植物對干旱脅迫的響應主要表現在外部形態和內部生理代謝方面。例如，植物通過減緩生長速率[2]、將更多的生物量分配到根部[3]、降低株高[4]、減少葉面積[5]、提高滲透調節物質含量[6]和抗氧化酶活性[7]等方式應對干旱脅迫環境。目前，關于垂穗披堿草耐旱性的研究主要集中于萌發期或幼苗期階段。馬青枝等[8]研究表明，聚乙二醇（PEG-6000）溶液對披堿草（E.dahuricus）萌發率、發芽勢和發芽指數等具有抑制作用，且其開始發芽天數和發芽高峰期均被推遲。但也有不同研究結果，余芳玲等[9]研究發現，50g/L PEG-6000處理有利于垂穗披堿草種子萌發。在垂穗披堿草苗期耐旱性研究中，張小嬌等[10]研究認為，干旱脅迫影響垂穗披堿草光合作用以及物質代謝，主要表現為葉綠素含量降低，脯氨酸、丙二醛和可溶性糖含量增加。干旱脅迫也影響垂穗披堿草的抗氧化清除系統。王傳旗等[11]研究表明，干旱脅迫14d后，垂穗披堿草葉片脯氨酸含量和過氧化氫酶活性下降。在垂穗披堿草耐旱性研究中，多是針對垂穗披堿草單個生育期進行單項機理研究。然而，干旱對植物的影響不僅是巨大的，而且表現在不同生長階段。因此，本文從垂穗披堿草萌發期和幼苗期2個階段入手，選取西藏那曲市班戈縣和索縣2個地區的2份野生垂穗披堿草為研究材料，同時以巴青垂穗披堿草為對照材料，探討垂穗披堿草在萌發期和幼苗期對干旱脅迫的生理響應，為選育耐旱性強的垂穗披堿草新品種提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與區域概況

野生垂穗披堿草種子于2016年9月采自西藏那曲市班戈縣和索縣。班戈縣屬高原亞寒帶半干旱季風氣候區，寒冷干燥，無絕對無霜期；年均氣溫0℃左右，年均日照2850h，年降水量289～390mm，年均蒸發量1993.40～2104.10mm。索縣屬高原亞寒帶季風氣候，冬春季多大風，年無霜期僅40d左右；年均氣溫-2℃，年均日照 2477.20h，年降水量572.90mm，年均蒸發量1460～1550mm[12]。采集的種子風干后于4℃保存。巴青垂穗披堿草（馴化品種）作為對照材料。材料來源見表1。

表1 材料與來源Table 1 Materials and source status

1.2 試驗方法

1.2.1 萌發期試驗 隨機選取垂穗披堿草種子各600粒，放入70%乙醇溶液中浸泡2min，用超純水沖洗備用[13]。配制水勢為 0.00、-0.10、-0.20、-0.40、-0.80和-1.00MPa的PEG-6000溶液[14]。采用紙上發芽法，培養皿中鋪雙層無菌濾紙，加5mL對應的PEG-6000溶液。每個培養皿中排25粒種子。每個處理4次重復。種子萌發試驗在PXZ智能光照培養箱中進行，發芽條件為30℃/20℃（晝溫/夜溫），光周期12h，光照強度4000lx。以芽長達到種子長度的 1/2作為種子發芽的判定標準[15]。試驗周期15d，為保證處理組的滲透勢不變，每隔2d稱重1次，用超純水補充蒸發的水分。

1.2.2 幼苗期試驗 在西藏農牧學院教學實習基地取土，拌入適量腐熟羊糞，于105℃烘箱中烘3h。將土壤（約3kg）裝入花盆中（20cm×15cm×25cm），播種100粒。3葉齡時開始間苗，保證每盆有50株幼苗；待苗齡為5葉期時進行干旱脅迫。采用停水處理的方法模擬干旱脅迫環境，并于試驗前 1d對每盆材料進行充分供水（作為對照組），干旱脅迫后每7d取樣一次，共取樣3次，每個處理3次重復。取樣部位為垂穗披堿草主莖向上第4片葉。

1.3 測定指標與方法

萌發率（germination percentage，GP）=（第15天發芽種子數/100）×100%；發芽指數（germination index，GI）=∑（Gt/Dt），Gt指第 t天的種子發芽數，Dt指相對應的發芽天數[16]；活力指數（vigor index，VI）=發芽指數×Sx，Sx 為平均根長[17]；根芽長（root and bud length，cm）：從每個處理隨機取15株幼苗進行測量，取平均值。

采用電導法測定相對電導率（relative conductivity，REC）[18]；采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量[18]；采用NBT還原法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性[19]；采用愈創木酚比色法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性[19]；采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性[19]。

1.4 耐旱性綜合評價

隸屬函數公式：U(Xi)＝(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin)。其中，U(Xi)為隸屬函數值；Xi為某指標的測定值；Xmin和Xmax為某指標的最小值和最大值。

隸屬度：依據隸屬函數公式求得垂穗披堿草相關指標在干旱處理下的具體隸屬函數值，然后將每份材料抗旱性指標的隸屬函數值累加求平均值[20]。隸屬度劃分標準[21]：0.6～0.7為強抗，定為Ⅰ級；0.4～0.6為較抗，定為Ⅱ級；0.3～0.4為弱抗，定為Ⅲ級；隸屬度＜0.3為不抗或易感，定為Ⅳ級。

1.5 數據分析

使用SPSS 19.0軟件進行數據分析，用Tukey’HSD檢驗樣本間的顯著性，用回歸分析來確定相關指標與干旱脅迫時間的關系。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下垂穗披堿草種子萌發特性

由表2可知，隨著滲透勢的降低，巴青垂穗披堿草的GP、GI和VI呈先升后降趨勢，而Ⅰ號和Ⅱ號的GP、GI和VI呈下降趨勢。-0.10MPa處理下，巴青垂穗披堿草種子 GP、GI和 VI均高于0.00MPa處理，但差異不顯著。-0.20MPa處理下，Ⅰ號和Ⅱ號的 VI較 0.00MPa處理顯著下降（P＜0.05）。-0.40MPa處理下，與0.00MPa處理相比，巴青垂穗披堿草的GI和VI顯著下降（P＜0.05）；Ⅰ號和Ⅱ號的GP和GI下降顯著（P＜0.05），VI極顯著下降（P＜0.01）。-0.80MPa處理下，與0.00MPa處理相比，巴青垂穗披堿草 GP顯著下降（P＜0.05），VI極顯著下降（P＜0.01）。

表2 干旱脅迫對垂穗披堿草種子萌發的影響Table 2 Effects of drought stress on seed germination of E.nutans

由表3可知，隨著滲透勢的降低，巴青垂穗披堿草根芽比呈上升趨勢，Ⅰ號和Ⅱ號根長、芽長呈下降趨勢。與0.00MPa處理相比，-0.10MPa處理下，巴青垂穗披堿草根長增加，但差異不顯著，之后隨著滲透勢降低而下降。-0.40MPa處理下，Ⅰ號和Ⅱ號芽長較 0.00MPa顯著下降（P＜0.05）。-0.80MPa處理下，巴青垂穗披堿草芽長較0.00MPa顯著下降（P＜0.05）。-1.00MPa處理下，Ⅰ號和Ⅱ號根長較0.00MPa顯著下降（P＜0.05），幼苗根芽比顯著上升（P＜0.05）。

表3 干旱脅迫對垂穗披堿草幼苗生長的影響Table 3 Effects of drought stress on growing of E.nutans seedlings

采用隸屬函數法對Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草萌發期相關指標進行綜合評價，其隸屬度依次為0.522、0.495 和 0.554（表 4）。

表4 干旱脅迫下垂穗披堿草種子萌發期屬函數值及隸屬度Table 4 Subordinate function value and subordinate degree of E.nutans under drought stress at germination stage

2.2 干旱脅迫下垂穗披堿草幼苗生理特征

逆境脅迫下，REC和MDA含量是鑒定植物細胞膜損傷程度的重要指標。隨著干旱脅迫天數的增加，幼苗葉片REC和MDA含量呈上升趨勢（表5）。與0d相比，干旱脅迫第7天，Ⅰ號葉片MDA含量顯著上升（P＜0.05），REC極顯著上升（P＜0.01）；Ⅱ號葉片REC顯著上升（P＜0.05），MDA含量極顯著上升（P＜0.01）；巴青垂穗披堿草葉片REC和MDA含量顯著上升（P＜0.05）。與0d相比，干旱脅迫第14天，Ⅰ號葉片MDA含量極顯著上升（P＜0.01），Ⅱ號葉片REC極顯著上升（P＜0.01），巴青垂穗披堿草葉片REC和MDA含量極顯著上升（P＜0.01）。通過線性回歸方程分析，干旱脅迫天數與Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草葉片MDA 含量關系分別為y=11.59x–5.20（R2=0.89）、y=12.18x–0.74（R2=0.86）和y=10.60x–6.07（R2=0.94）；干旱脅迫天數與Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草葉片 REC的關系分別為y=12.88x+1.98（R2=0.90），y=16.79x–2.85（R2=0.99）和y=14.17x–8.15（R2=0.99）。

表5 干旱脅迫對幼苗細胞膜損傷程度的影響Table 5 Effects of drought stress on cell membrane damage degree of seedlings

幼苗葉片SOD、POD和CAT活性均隨干旱脅迫天數的增加而升高，并分別在干旱第21天出現了小幅度下降現象（表6）。與0d相比，干旱脅迫第7天，3個材料葉片SOD、POD和CAT活性顯著上升（P＜0.05）；干旱脅迫第14天，葉片SOD活性極顯著上升（P＜0.01）。通過多項式回歸方程分析，干旱脅迫天數與Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草葉片 SOD活性關系分別為y=-6.87x2+50.11x–18.37（R2=0.88）、y=-4.38x2+36.21x–15.47（R2=0.92）和y=-4.63x2+40.9x–3.87（R2=0.88）；干旱脅迫天數與Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草葉片POD活性關系分別為y=-22.81x2+164.17x–31.97（R2=0.95）、y=-4.38x2+36.21x–15.47（R2=0.92）和y=-13.03x2+96.58x+99.17（R2=0.96）；干旱脅迫天數與Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草葉片 CAT活性關系分別為 y=-3.36x2+22.74x–9.22（R2=0.99）、y=-24.45x2+163.32x–25.98（R2=0.97）和y=-2.42x2+21.4x–2.17（R2=0.92）。

表6 干旱脅迫下幼苗葉片抗氧化酶活性變化Table 6 Changes of antioxidant enzyme activities in seedling leaves under drought stress

采用隸屬函數法對Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草幼苗期相關生理指標進行了綜合評價，其隸屬度依次為0.591、0.580和0.598（表7）。

表7 垂穗披堿草幼苗期隸屬函數值及隸屬度Table 7 Subordinate function value and subordinate degree of E.nutans at seedling stage

3 討論

3.1 種子萌發對干旱脅迫的生理響應

本研究中，-0.10MPa處理下，巴青垂穗披堿草種子GP、GI和VI均高于0.00MPa處理，說明低濃度的PEG-6000溶液有利于巴青垂穗披堿草種子萌發。其原因可能是低滲透勢引發了種子內部相關酶的活性，從而提高了種子萌發率[22]。這與王傳旗等[23]研究結果一致。王傳旗等[24]研究表明，高濃度的PEG-6000溶液滲透勢抑制了垂穗披堿草種子萌發，本研究也證實了這一點，-0.20MPa及以下水分虧缺條件下，巴青垂穗披堿草種子萌發受到了抑制。本研究中，PEG-6000抑制了Ⅰ號和Ⅱ號種子萌發，主要表現為隨著PEG-6000滲透勢的降低，GP、GI和VI呈下降趨勢。

在干旱或缺水區，水分是限制植物生長的主要生態因子，為適應干旱脅迫環境，植物會調整器官的生長[25]。巴青垂穗披堿草芽長隨著PEG-6000滲透勢的降低而持續下降，但其根長在-0.10MPa處理下高于0.00MPa。表明低濃度PEG-6000溶液處理下，巴青垂穗披堿草將更多的生物量分配到根部，以促使其向地下更深處生長，這是垂穗披堿草適應干旱環境的重要方式，同時對其在西藏半干旱地區的生存延續具有重要的生物學意義。此結果與王傳旗等[26]在西藏野生老芒麥種子萌發對溫度和水分的響應中的研究結果相類似。此外，本研究中，PEG-6000滲透脅迫對垂穗披堿草幼苗地上部分生長的抑制作用大于地下部分。這與汪建軍等[27]研究結果類似。

3.2 幼苗對干旱脅迫的生理響應

隨著干旱脅迫天數的增加，幼苗葉片 REC不斷升高，原因可能是細胞脫水導致其質膜變形，使細胞內的電解質外滲所致[28]。Sclote等[29]研究表明，植物細胞膜脂過氧化程度會隨干旱脅迫時間的延長而增加。本試驗也證實了這一結果，隨著干旱脅迫天數的增加，幼苗葉片MDA含量呈上升趨勢，并在干旱脅迫至第21天時最大。隨著干旱脅迫天數的增加，幼苗REC和MDA含量呈上升趨勢，表明垂穗披堿草幼苗已經受到了干旱脅迫的傷害。

幼苗葉片SOD、POD和CAT活性隨著干旱脅迫天數的增加而升高，并在干旱脅迫至第14天時，均達到了最高水平。這與許令明等[30]對花葉蘆竹（Arundodonaxvar.versicolor）和許愛云等[31]對苜蓿（Medicagosativa）的研究結果類似。表明干旱脅迫下，垂穗披堿草啟動了體內的抗氧化清除系統，并通過提高保護酶活性來適應不利的干旱脅迫環境，這也是垂穗披堿草適應干旱環境的重要途徑之一。當干旱脅迫至21d時，幼苗SOD、POD和CAT活性均出現了小幅度的下降現象。這可能是干旱脅迫天數超過了垂穗披堿草對干旱脅迫的耐受期，使其葉片細胞內的各種代謝出現紊亂所致。

4 結論

適宜巴青垂穗披堿草種子萌發的 PEG-6000滲透勢范圍為0.00～-0.10MPa。干旱脅迫第14天為Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草幼苗耐旱的轉折點，第21天為其耐旱的極限。供試的3份垂穗披堿草萌發期和幼苗期隸屬度均介于0.4～0.6，屬于Ⅱ級（較抗）。綜上，Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草可作為西藏鄉土禾草植物抗旱性育種的重要種質材料，但鑒于植物抗旱性的復雜性和提高西藏旱區牧草生產的緊迫性，應積極組織對其進行長期系統的綜合研究。