miR398和miR408 對UV-B脅迫下擬南芥幼苗的影響

陜永杰,張美萍，冀麗蓉,李丹,張莉,沈振國

1.山西師范大學地理科學學院，山西 臨汾，041000；2.山西師范大學生命科學學院，山西 臨汾，041000；3.南京農業大學生命科學學院，江蘇 南京，210094

MicroRNAs (miRNAs)是一類參與 mRNA 轉錄后調控的非編碼單鏈小 RNA，在植物器官形成、發育與分化信號通路及基因表達中均有重要作用[1].逆境脅迫可誘導某些 miRNA 表達并在多種脅迫中發揮重要的調控作用[2，3].Sunkar等發現，擬南芥幼苗的 CSD1 和 CSD2 在高濃度Cu2+和高濃度 Fe3+下的表達水平受miR398調控，消除氧化基團，減輕植物受脅迫的損傷[3～5].miR408 對低溫、干旱、重金屬等多種非生物脅迫均有響應[6，7].miR398 和miR408 雖可對植物遭遇的多種脅迫產生應答，但其應答機制有待研究.

近年來，隨著氯氟烴化合物等大量使用，臭氧層加速損耗，臭氧層的減少導致到達地表面的UV-B(波長 280 nm～320 nm)輻射增加[8].研究表明，增強UV-B 輻射影響了植物的生長發育、生理生化過程、細胞活動、分子調控機制等均產生顯著變化[9～11].UV-B輻射引起的光氧化會對光合系統造成損傷，引起光抑制[12～14].UV-B 輻射對PSⅡ的影響要遠大于對PSⅠ的影響[15,16]，損傷了捕光系統和耗散保護機制，破壞了植物的光合系統，使其光合效率下降[17].UV-B脅迫下，膜脂過氧化及清除自由基的能力加劇.為應對脅迫，植物形成了一系列防御保護機制[18].Jia等在歐洲大葉楊中研究了24個miRNA發現，在 UV-B 輻射下，13個miRNA上調表達，11個下調表達[19,20].本研究通過研究miR398 和miR408 對 UV-B 輻射脅迫的響應，為作物育種提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料及培養 選用哥倫比亞(Columbia-0)生態型野生擬南芥作為對照組，過表達miR398 和過表達miR408 擬南芥均購于擬南芥種子資源庫.用1 %的次氯酸鈉進行種子消毒，無菌水清洗，播種于MS培養基上，低溫(4 ℃)48 h，23 ℃光照培養箱中培養，濕度為70 %，光照時間為 16 h，暗處理8 h，待擬南芥長出兩片真葉時移栽到土壤基質(泥炭土∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1)中，進行實驗處理.

1.1.2 材料處理設置 共設置四個處理組，分別是正常光照下野生型擬南芥組(WT)，過表達miR398/miR408 擬南芥組(miR398/miR408)，UV-B 輻射下的野生型擬南芥組(WT-UVB)，UV-B輻射下的過表達miR398/miR408 擬南芥組(miR398-UVB/miR408-UVB).光照強度為 2 000 Lx，培養溫度23 ℃，濕度為70 %，UV-B 輻射劑量為 10.08 kJ·m-2d-1，紫外燈光規格30 W，297 nm(南京華強生產)，各實驗處理組設置如表1.

表1 各實驗處理組的設置Tab.1 Setup of each experimental treatment group

1.2 方法

1.2.1 光合系統指標測定 移栽土壤培養 20 d 時進行指標測定，參考高俊鳳的方法[21]，將各處理組的植物放在黑色罩中暗適應 30 min，選擇正常生長的葉片，在不離體的條件下用葉夾夾住葉片，測定初始熒光F0，最大熒光Fm，按公式Fv=Fm-F0為可變熒光Fv，Fv/Fm為 PSⅡ最大光化學效率，再測得Fm′、F0′、Fs，根據計算公式測得：非光化學淬滅(NPQ)及光化學淬滅系數qP，公式如下

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm

1.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定 采用氮藍四唑光還原法測定SOD酶活性.稱取 0.5 g 葉片，加入 2 mL 預冷的提取介質于冰浴中研磨成漿液，定容至10 mL，取 5 mL提取液 4 ℃，10 000 r/min 離心 15 min，提取上清液即為 SOD 粗提取液，測定560 nm 處的吸光度.

1.2.3 谷胱甘肽(GSH)含量的測定 采用 DINB 顯色法測定 GSH 含量，取 0.5 g 新鮮植物葉片，加入 5 mL 5 % TCA，充分研磨均勻，15 000 r/min 離心 15 min，取上清液 1 mL，加入 5 mL 磷酸緩沖液(pH=7.7，0.15 mmol/L)，加入 30 μL DTNB，反應后，以 5 % TCA 為空白，于412 nm測定吸光度.

1.2.4 丙二醛(MDA)含量的測定 依照張志良的方法[22]，稱取葉片 0.3 g，加入 2 mL 0.05 mol·L-1磷酸緩沖液，迅速研磨成漿液，加入5 mL 0.5 %硫代巴比妥酸提取液，沸水浴中沸騰 10 min，冷卻，離心，測定532 nm、600 nm、450 nm 處吸光度.

1.2.5 數據統計與分析 采用 SPSS 17.0 與 Origin 軟件對實驗數據進行 LSD 和 DUNCAN 顯著性分析，并作圖.測定的試驗數據均選用P<0.05，從最高到最低標記 a、b、c、d.

2 結果

2.1 增強 UV-B 輻射對擬南芥各處理組葉綠素熒光動力學參數的影響

Fv/Fm表示 PSⅡ原初光能轉化效率[23]，由圖 1A 可知，正常生長情況下，野生型植株Fv/Fm高于過表達miR398 擬南芥，差異不顯著(P>0.05).UV-B 輻射處理后，野生型擬南芥葉綠素熒光動力學參數Fv/Fm顯著下調 10.19%(P<0.05)，過表達miR398 擬南芥顯著下調 16.18 % (P<0.05).表明UV-B 顯著降低了擬南芥的原初光能轉化效率，而miR398 的過表達更大程度上降低了植株原初光能轉化效率，損害植株生長.由圖 1B可知，正常光照下，野生型植株Fv/Fm高于過表達miR408 擬南芥，但差異不顯著(P>0.05).UV-B 輻射處理后，過表達miR408 擬南芥顯著下調 12.71%(P<0.05).表明 UV-B顯著降低了擬南芥的原初光能轉化效率，過表達miR408 進一步降低了植株的原初光能轉化效率，影響了光合能力，損害植株生長.

圖1 擬南芥各處理組光合參數 Fv/Fm 變化Fig.1 Changes of photosynthetic parameters Fv/Fm in Arabidopsis treatment groups

qN非光化學淬滅表示的是植物耗散過剩光能轉化為熱能的能力[24]，由圖 2A 可知，正常光照下，野生型植株qN值低于過表達miR398 擬南芥，但差異不顯著(P>0.05).UV-B 輻射處理后，野生型擬南芥qN值顯著上升 11.42%(P<0.05)，過表達miR398 擬南芥顯著上升18.67%(P<0.05).表明在 UV-B 脅迫誘導下，miR398 基因調控擬南芥響應輻射，過表達miR398 擬南芥耗散過剩光能為熱能的能力更強，不利于植株生長.由圖 2B 可知，正常光照下，野生型植株qN值低于過表達miR408 擬南芥，差異不顯著(P>0.05).UV-B 輻射處理后，過表達miR408 擬南芥顯著上升 19.88%(P<0.05).表明在 UV-B 脅迫誘導下，過表達miR408 擬南芥耗散過剩光能為熱能的能力更強，影響植株生長.

圖2 擬南芥各處理組光合參數 qN 的變化Fig.2 Changes of photosynthetic parameters qN in Arabidopsis treatment groups

qP光化學淬滅反映光系統Ⅱ (PSⅡ)原初電子受體QA的還原狀態，qP越大，表明 PSⅡ電子傳遞活性越大[25].由圖 3A可知，正常光照下，野生型植株qP值高于過表達miR398 擬南芥(P>0.05).UV-B 輻射處理后，野生型擬南芥qP值顯著下降 12.26%(P<0.05)，過表達miR398 擬南芥顯著下降 17.90%(P<0.05).表明 UV-B 脅迫會降低擬南芥的 PSⅡ電子傳遞活性，而過表達miR398擬南芥進一步降低 PSⅡ電子傳遞活性，影響植株生長.由圖 3B 可知，正常光照下，野生型植株qP值高于過表達miR408 擬南芥，差異顯著(P<0.05).UV-B 輻射處理后，野生型擬南芥qN值顯著下降 12.26%(P<0.05)，而過表達miR408 擬南芥顯著下降 27.46%(P<0.05).表明在 UV-B 脅迫會降低擬南芥的 PSⅡ電子傳遞活性，而過表達miR408 基因的擬南芥進一步降低 PSⅡ電子傳遞活性，光合效率降低，影響植株生長.

圖3 擬南芥各處理組光合參數 qP 的變化Fig.3 Changes of photosynthetic parameters qP in Arabidopsis treatment groups

以上結果表明，UV-B 脅迫葉綠素熒光動力學參數Fv/Fm、qP數值降低、qN數值升高，降低光合效率，而過表達miR398 和miR408 降低 UV-B 脅迫下的葉綠素熒光動力學參數Fv/Fm、qP數值、增加qN數值，降低光合作用效率，影響了植株生長發育.

2.2 增強 UV-B 輻射對擬南芥各處理組中抗氧化酶活性的影響

植物遭遇脅迫時，植物體調動抗氧化酶類(SOD酶、CAT酶、POD酶等的活性)和抗氧化物質(GSH、AsA 等)含量清除活性氧及氧自由基等，從而降低脅迫造成的細胞損傷.植物的防御能力與抗氧化能力具相關性.由圖 4A 可知，正常光照下，野生型植株 SOD 酶活性高于過表達miR398 擬南芥(P<0.05).UV-B 輻射處理后，野生型擬南芥 SOD 酶活性顯著下降22.42 % (P<0.05)，過表達miR398 擬南芥顯著下降 48.97 % (P<0.05).表明 UV-B 脅迫會導致擬南芥 SOD 酶活性降低，而表達miR398 基因的擬南芥進一步降低 SOD 酶活性，從而 影響植物自我修復，對生長造成影響.由圖 4B 可知，正常光照下，野生型植株 SOD 酶活性高于過表達miR408 擬南芥，差異顯著(P<0.05).過表達miR408 擬南芥顯著下降 54.23 % (P<0.05). 表明 UV-B 脅迫會導致擬南芥 SOD 酶活性降低，而過表達miR408 基因擬南芥進一步降低 SOD 酶活性降低，從而影響植物自我修復，影響植物生長.

圖4 擬南芥各處理組 SOD 酶活性的變化Fig.4 Changes of SOD content in Arabidopsis treatment groups

由圖 5A 可知，正常光照下，野生型植株 GSH 含量高于過表達miR398 擬南芥(P<0.05). UV-B 輻射處理后，野生型擬南芥 GSH 含量顯著下降 42.86 % (P<0.05)，過表達miR398 擬南芥顯著下降 50 % (P<0.05).表明 UV-B 脅迫會導致擬南芥 GSH 含量減少，而表達miR398 基因的擬南芥進一步降低 GSH 含量，細胞清除活性氧自由基的能力下降，降低植物防御能力.由圖 5B 可知，野生型植株 GSH 含量高于過表達miR408 擬南芥(P<0.05).UV-B 輻射處理后，野生型擬南芥 GSH 含量顯著下降 42.86 % (P<0.05)，而過表達miR408 擬南芥顯著下降 47.62 % (P<0.05).表明 UV-B 脅迫會導致擬南芥 GSH 含量減少，而過表達miR408擬南芥降低 GSH 含量，細胞清除活性氧自由基的能力下降，氧自由基的積累不利于植物的生長.

圖5 擬南芥各處理組 GSH 含量的變化Fig.5 Changes of GSH content in Arabidopsis treatment groups

2.3 增強 UV-B 輻射對擬南芥各處理組中丙二醛含量的影響

植物在逆境脅迫下受到損害，這與活性氧積累導致植物膜脂的過氧化作用相關，而作為膜脂過氧化產物之一 MDA，其含量的變化可以反映膜系統受損程度.由圖 6A 可知，正常光照下，野生型植株與過表達miR398 擬南芥中 MDA 含量無顯著差異(P>0.05).UV-B 輻射處理后，野生型擬南芥 MDA 含量顯著上升 6.71 % (P<0.05)，過表達miR398 擬南芥顯著上升 12.41% (P<0.05).表明 UV-B 脅迫導致擬南芥 MDA 含量升高，膜脂過氧化程度加深，而過表達miR408 擬南芥增加 MDA含量，損傷細胞膜.由圖6B 可知，正常光照下，野生型植株低于過表達miR408 擬南芥中 MDA 含量(P<0.05).UV-B 輻射處理后，野生型擬南芥 MDA 含量顯著上升 8.28 % (P<0.05)，過表達miR408 擬南芥顯著上升 65.52 % (P<0.05).表明 UV-B 脅迫會導致擬南芥 MDA 含量升高，活性氧積累，膜脂過氧化程度加深，而過表達miR408 擬南芥的 MDA 含量增加，MDA大量積累對植物造成不可修復的傷害.

圖6 擬南芥各處理組 MDA 含量的變化Fig.6 Changes of MDA content in Arabidopsis treatment groups

結果表明，UV-B 脅迫造成了擬南芥幼苗的 SOD酶活性、GSH 含量降低，MDA 含量上升，活性氧積累，而過表達miR398 和miR408 會進一步增加 UV-B 脅迫下的活性氧含量，降低植物清除氧自由基的能力，影響植物抵抗輻射逆境脅迫，損害植株生長發育過程.

3 討論與結論

近年來，由于臭氧層減薄導致到達地表的 UV-B 輻射增強影響了植物正常生長，使得農作物產量減少[26].增強UV-B 輻射對植物的光合能力下降、抗氧化系統及 DNA 造成不同程度的損傷.強烈的紫外輻射還可破壞植物葉片中的葉綠體超微結構，光合色素合成受到抑制，最終導致光合速率的下降，影響植物生長發育[27].研究發現，受 UV-B 輻射脅迫的野生型擬南芥與正常光下的擬南芥相比，葉綠素的熒光動力學參數Fv/Fm值下降，光能轉化率降低，qN非光化學淬滅系數升高，植物耗散過剩光能轉化為熱能的能力增強，qP造成 PSⅡ電子傳遞活性下降，這表明 UV-B 脅迫嚴重影響植物的光合作用過程，光合速率下降.此外，在 UV-B 脅迫等非生物脅迫下，植物體會產生大量活性氧，活性氧對細胞組織和生物大分子具有攻擊性，少量活性氧可以作為激起植物脅迫響應和防御反應的信號分子，但過量活性氧容易造成細胞損傷.本研究發現，受 UV-B 輻射脅迫的野生型擬南芥與正常日光下的擬南芥相比，植物體內 SOD 酶活性降低，GSH 含量降低，過氧化產物 MDA 含量上升.這表明 UV-B 脅迫使得 SOD 酶活性降低和 GSH 含量減少，植物體內清除氧自由基的能力下降，造成了擬南芥體內活性氧的積累，最終導致膜脂過氧化程度加深，損傷細胞膜，影響植物生長.前人研究發現 UV-B 輻射脅迫通過對植株體中光受體的影響，致使光信號導入細胞核[28]，在相關作用元件下 miRNAs 表達發生改變，影響了植物的生長發育及器官形成等[29，30].此過程中，miRNAs 的表達模式響應了 UV-B 輻射脅迫.miR398 和miR408 受多種逆境脅迫誘導并參與多種脅迫的調控，如干旱、高鹽、重金屬脅迫等[3～5，7].

本研究發現miR398 和miR408 均響應 UV-B 輻射脅迫.過表達miR398 和miR408 會進一步降低 UV-B 脅迫下的葉綠素熒光動力學參數Fv/Fm、qP、增加qN，降低光合作用效率，影響植株生長發育.此外，過表達miR398 和miR408 擬南芥增加 UV-B 脅迫下活性氧含量，降低植物清除氧自由基的能力，影響植物抵抗輻射逆境脅迫，損害植株生長發育過程.這表明過表達miR398 和miR408 的擬南芥植株抗逆性更差，但miR398 和miR408對 UV-B 脅迫應答機制還不完善，有待進一步研究.