廣西某金屬冶煉廠工人鎘暴露與認知相關基因甲基化的關聯

劉秋梅，喻國旗，張志勇，2a，農春濤，蔡建升，2b，徐敏，張君玲，許霞，劉淑珍，韋春梅，覃健

1.廣西醫科大學公共衛生學院環境衛生學教研室，廣西 南寧 530021

2.桂林醫學院 a.公共衛生學院環境衛生與職業醫學教研室 b.廣西腫瘤免疫與微環境調控重點實驗室，廣西 桂林 541199

鎘是在蓄電池、電鍍、電器制造等生產領域中廣泛使用的有毒金屬，可誘發神經毒性［1］。Hart 等［2］率先發現職業鎘暴露可導致工人認知功能的損傷。人群研究表明，高濃度鎘暴露與老年人［3］及兒童［4］的認知功能呈負相關。鎘暴露還可增加職業工人阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）的發病風險［5］。動物實驗也提示，鎘的持續暴露會損害C57BL/6 雄性小鼠的認知及嗅覺記憶［6］。然而在最近的一項研究中，使用來自AD患者和無癡呆的老年對照的死后腦樣本，AD病例的額葉皮層中的鎘濃度低于對照［7］，Przybyla等［8］也未發現鎘暴露與認知功能有關聯。故關于鎘暴露與認知功能的關聯性，不同研究結果存在異質性，仍需開展更多的研究。

金屬暴露對健康的作用可能與表觀遺傳改變有關，而DNA 甲基化可能在其中發揮重要作用。既往研究發現KL（klotho）、腦源性神經營養因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）、淀粉樣蛋白前體（amyloid protein precursor，APP）基因是神經功能發育、修復、退行性變等過程的重要調節基因。KL基因是重要的抗衰老基因［9］，其過表達可有效改善小鼠的認知缺陷和AD 樣病理改變［10］，而KL基因敲除小鼠則會出現記憶功能障礙、海馬神經退行性變等［11］。BDNF是一種認知相關蛋白，對神經元的生長、發育和維持起保護作用。Meta分析結果顯示AD病人的BDNF水平低于健康人群［12］。APP衍生的C端片段（APP-CTF）的積累會觸發過量線粒體形態的改變，缺陷的線粒體在AD 的發病機制起重要作用［13］。大量研究表明，基因甲基化在重金屬暴露致軀體功能損害過程中的作用不容忽視。本研究擬通過對廣西某冶煉廠職工展開流行病學研究，探索不同鎘暴露水平與認知相關基因甲基化之間的關聯性，為重金屬職業暴露者的健康防護提供科學依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

所有研究對象均來自廣西某金屬冶煉廠工人，參與2017年職業體檢，并完成一般情況問卷調查及血樣、尿樣的采集。體檢資料納入標準：（1）工齡≥3月的18～60 歲職工；（2）無其他職業危害因素接觸史，如苯、一氧化碳等；（3）身體系統無明顯疾??；（4）所有研究對象均愿意參加本項目并知情同意。排除標準為：（1）問卷資料不全；（2）確診神經官能癥患者；（3）尿鉛（urinary lead，UPb）濃度超標（前期抽檢發現鎘和鉛為該廠工人主要重金屬暴露）。共有1 010名工人的資料符合標準，對他們進行尿鎘（urinary cadmium，UCd）、UPb、尿肌酐測定，并根據尿肌酐校正后的UCd水平（＜P25，P25～P75，＞P75）將1 010 名工人分為低、中、高暴露組，各暴露組工人按年齡、性別進行分層，采用頻數匹配法從各暴露組隨機抽取各150 例樣本進行甲基化水平測定，最終納入分析的共有450 例研究對象。

本次研究獲得廣西醫科大學倫理委員會的批準（批準號：20160302-11），所有參與研究的職工均在受檢之前簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 調查內容由經過培訓的調查員采用統一設計的調查問卷對受訪對象進行面對面調查，收集包括基本人口學特征、生活行為習慣（飲酒、吸煙）、工齡、職業暴露史等資料。過去30 d 中，至少飲過半瓶啤酒/2.5 兩葡萄酒或果酒/0.8 兩白酒（1 兩等于50 g）視為飲酒；每天吸煙1 支及以上，連續或累積≥6 個月視為吸煙。

1.2.2 血液、尿液樣本采集抽取研究對象空腹靜脈血15 mL，用于血生化檢測及DNA 提取等。剩余樣本置于-80℃低溫冰箱凍存，以備后續檢測。留取受檢者中段尿樣約20 mL，于4℃保存，待后續測定。

1.2.3 UCd、UPb、尿肌酐水平檢測研究對象UCd、UPb 水平的檢測采用石墨爐原子吸收光譜法（島津AA-6300C，日本），具體操作方法參照文獻［14］。低于檢出限水平的值以檢出限/ 代替。尿肌酐水平的測定采用96 微孔板肌氨酸氧化酶法（南京建成，中國）。最終納入分析的UCd、UPb 水平均為經尿肌酐調整后的水平。

1.2.4 KL、BDNF、APP基因甲基化水平檢測對450例抽樣人群進行外周血基因組DNA 的提??；隨后利用MethylTarget 技術，結合多重PCR 進行測序，檢測KL、BDNF、APP基因各CpG 位點的甲基化水平。利用軟件（http://primer3.ut.ee/）進行引物設計、序列比對及CpG島分析等。相關引物詳見表1。

表1 目的基因甲基化特異性引物序列Table 1 Specific primer sequences of target gene methylation

1.3 質量控制

所有調查員經過統一培訓，嚴格按照調查標準進行。生物樣本采集后迅速放入4℃冷藏箱內。使用EpiData 軟件進行數據的雙人雙錄入。UCd、UPb 水平測定時，每間隔15 個樣本測定一次鎘、鉛標準品濃度進行質控，并將平行樣的變異度控制在5%以內；加標回收率控制在80%～120%。此外，尿肌酐測定設置5次平行樣檢測，相對標準偏差控制在5%以內。

1.4 統計學分析

所有分析均在SPSS 23.0、R 4.0.2 中完成。將UCd水平進行常用對數（lg）轉換納入樣條分析。計數資料用率表示，組間比較采用卡方檢驗；正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間差異采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用LSD；不服從正態性的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。限制性立方樣條分析用于探索UCd與基因甲基化水平的暴露-效應關系。通過Mann-WhitneyU檢驗分析各暴露組兩組之間特定基因CpG位點甲基化水平的差異。雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 研究對象的基本情況

本研究最終納入450名研究對象，包含377名男性（83.78%）和73 名女性（16.22%），年齡為（38.88±6.87）歲，尿鎘水平的M（P25，P75）為2.73（1.04，5.75）μg·g-1（經尿肌酐校正，后同），UCd 水平在低、中、高暴露組間差異有統計學意義（P＜0.001）。研究對象多數為己婚或再婚（90.89%），初中及以下文化程度占半數以上（62.00%），婚姻狀況及文化程度存在組間差異（P＜0.05）。性別、年齡、民族、飲酒、吸煙情況、工齡及體重指數（body mass index，BMI）在各暴露組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各暴露組研究對象的基本情況［例數（構成比/%）］Table 2 Characteristics of study subjects with different levels of cadmium exposure [n (proportion/%)]

2.2 不同鎘暴露組間APP、BDNF、KL 基因甲基化率的比較

APP、BDNF、KL三個基因平均甲基化率分別為（1.52±0.34）%、（4.55±1.08）%、（2.34±0.39）%。APP基因04 片段、KL基因及其02 片段的甲基化率在各暴露組組間存在差異（P＜0.05）。APP基因04 片段在低、中暴露組間比較有差異，中暴露組甲基化水平較低（P＜0.05）；而KL基因及其02 片段平均甲基化率在低暴露組分別與中、高暴露組之間比較均有差異（P＜0.05），中、高暴露組甲基化率低于低暴露組。見表3。

表3 不同暴露組間各目的基因甲基化率比較Table 3 Comparison of gene methylation rates between different exposure groups單位（Unit）：%

2.3 UCd水平與KL 基因甲基化率的暴露-效應關系

組間比較顯示KL基因低-中、低-高暴露組比較均有差異，限制性立方樣條分析UCd 水平（常用對數lg 轉換）與KL基因甲基化水平的暴露-效應關系，結果顯示，調整婚姻狀況、文化程度后，UCd 水平與KL基因甲基化水平呈負相關（P=0.035），并且存在線性暴露-效應關系（圖1），隨著UCd 水平升高，KL基因甲基化水平降低。

圖1 鎘暴露水平與KL 基因甲基化水平相關性的限制性立方樣條圖Figure 1 Restricted cubic spline plot of the correlation between urinary cadmium levels and KL gene methylation rate

2.4 不同暴露組間基因CpG 位點甲基化水平分析

采用Mann-WhitneyU檢驗進行KL、APP、BDNF三個目的基因的CpG 位點的組間比較。表4僅列出差異具有統計學意義的CpG 位點、組間甲基化差異程度及其P值。低暴露組與中暴露組比較，隨著暴露濃度的增加，三個目的基因的CpG 位點改變具有統計學意義的位點個數分別為：APP基因2 個，BDNF基因7 個，KL基因5 個（均P＜0.05）。中、高暴露組間比較，APP基因在共有3 個CpG 位點存在差異，KL基因2個，BDNF基因5 個；低暴露組與高暴露組比較，APP、KL基因CpG 位點平均甲基化水平存在差異共3 個（P＜0.05），而BDNF基因的CpG 位點甲基化水平在低、高暴露組間差異無統計學意義。

表4 不同基因CpG 位點平均甲基化率的組間比較Table 4 Comparison of average methylation rates of CpG loci of selected genes between different exposure groups

3 討論

鎘暴露引起機體認知功能損傷的確切機制尚不清楚。本研究通過對職業鎘暴露人群認知相關基因的甲基化研究，結果發現低、中濃度尿鎘暴露可能與KL、APP基因甲基化率降低有關。方差分析顯示KL基因平均甲基化水平在低-中、低-高暴露組間存在差異，限制性立方樣條提示鎘暴露與KL基因甲基化率呈負相關。Guan 等［15］發現鎘處理可降低果蠅39 個基因甲基化水平，這些基因與發育、繁殖和能量代謝有關。同時有研究發現宮內鎘暴露可致新生兒基因出現全基因組低甲基化現象［16］。KL基因主要在脈絡叢和神經元細胞中高表達，與神經退行性疾病相關，鎘暴露引起該基因甲基化水平降低可能導致海馬退行性變，進而損傷認知功能。動物研究發現KL高表達小鼠表現出更好的認知功能［17］。金屬鎘暴露與KL基因甲基化的關系及其對認知功能的影響有待進一步研究。

鎘、鉛聯合暴露致雄性大鼠中海馬和皮質中淀粉樣蛋白的產生，介導了APP的表達［18］。Hou等［19］觀察到AD患者的APP基因整體甲基化水平低于正常人群，且其表達水平與AD 病情嚴重程度呈正相關。本研究對職業人群鎘暴露與APP基因甲基化水平的關聯性進行首次探討，結果顯示低鎘暴露組APP基因04片段的平均甲基化率高于其他兩個暴露水平，與中暴露組比較有差異。該結果支持了鎘暴露與APP基因甲基化的關聯性，即低濃度的鎘暴露可引起APP基因去甲基化從而改變轉錄并誘導APP基因過表達，進而增加了淀粉樣蛋白的產生并在認知功能障礙和AD 發病機制中起重要作用，需要進一步研究以探索其相關機制。

本研究結果顯示不同暴露組間BDNF甲基化水平無差異。目前關于鎘或其他重金屬暴露與BDNF基因的甲基化水平的關聯性研究較少。在一項移民孕婦研究中發現，孕早期重金屬Pb、Hg、Cd 暴露與BDNF濃度之間無相關性［20］。研究表明，錳暴露可降低職業工人血漿BDNF水平和認知能力［21］。BDNF基因的甲基化狀態，尤其是其啟動子區域的甲基化狀態，是與精神疾病有關的最重要參數之一［22］，在男性精神分裂癥患者中發現BDNF啟動子甲基化水平更高。海馬中BDNF基因外顯子IX 的DNA 甲基化增加進而引起BDNFmRNA的表達下降，是影響大鼠及其后代的學習記憶障礙和認知障礙的重要原因之一［23］。由于本研究樣本量較少，因此，需要更大樣本量的進一步研究來確認二者的關聯性及其對認知功能的影響。

本研究的優勢在于對重金屬鎘與3 個基因甲基化水平的關聯性進行探討，但仍有部分局限性：首先，作為金屬暴露與相關基因甲基化的關聯性探討，本研究納入樣本量較少，差異具有統計學意義的CpG 位點的相關性有待進一步功能性驗證；另外，本次調查僅針對廣西某冶煉廠職工，對于其他職業性金屬鎘暴露高危人群以及普通人群外推性較弱。

綜上，鎘暴露可能與KL、APP基因低甲基化率有關，KL基因甲基化率與UCd 水平呈負相關。