朱砂葉螨幾丁質脫乙?；窽ecCDA5基因克隆及表達特征分析

宋莉紅，丁 超，陳 研，卜春亞

(北京農學院 生物與資源環境學院/農業農村部華北都市農業重點實驗室，北京 102206)

朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)為世界性主要害螨之一，又名紅蜘蛛，俗稱“紅蛐”[1]。朱砂葉螨屬于植食性螨類，幾乎危害所有的闊葉植物，分布廣泛且主要分布在溫暖地區[1]。該害螨主要附著在寄主植物葉片的背面吸食汁液，其種群世代周期短，繁殖較快，為害周期長，有性生殖與孤雌生殖同時存在[2]。朱砂葉螨繁殖快和分布廣泛等，對多種經濟作物造成了嚴重的損失，引起了經濟學家和作物學家以及各界學者的密切關注[3]。

目前人們對于朱砂葉螨的防治主要以化學防治為主，常用有炔螨特、氟蟲脲、噠螨靈、阿維菌素等殺螨劑[4]。但是引起的農藥殘留、環境污染和農藥降解等一系列環境問題也越來越嚴重，而且長期使用導致朱砂葉螨產生了一系列的抗藥性[5]。

幾丁質脫乙?；?CDA)廣泛存在于昆蟲、細菌和真菌中，且不存在于哺乳動物和高等植物中[6]。幾丁質脫乙?；甘怯绊懤ハx表皮發育的關鍵酶，是昆蟲體內常見的代謝酶類，涉及昆蟲的蛻皮、發育、免疫等多方面的功能[7]。其主要作用是將幾丁質去乙?；到鉃闅ぞ厶?，維持昆蟲體內的幾丁質代謝平衡[8]。

1984年，首次在魯氏毛霉(Mucorroxianus)的提取物中發現了幾丁質脫乙?；?，此后對幾丁質脫乙?；傅难芯吭絹碓缴钊隱9]。隨著幾丁質脫乙酰酶研究的深入，發現昆蟲CDA種類眾多且廣泛分布于各個器官中[10,11]。CDAs分為五個家族(GroupⅠ-GroupⅤ)，每個家族的結構與組成，組織特異性和功能特異性都存在較大差異。GroupⅠ、GroupⅡ的CDAs會影響昆蟲蛻皮的發展，在沒有CDA的情況下會導致昆蟲氣管，翅鞘和關節的異常發育。 目前對GroupⅢ和GroupⅣ的CDAs的組織定位尚不十分明確，GroupⅤ的CDAs在中腸中的表達較多[7]。

幾丁質脫乙?；冈诤︱陌l育過程中扮演了重要角色，可作為生物防治的潛在靶標基因[12]。就此本研究克隆朱砂葉螨CDA5a、CDA5b、CDA5c基因且分析其表達特征，為闡明朱砂葉螨幾丁質脫乙?；讣易宓墓δ艿於ɑA。

1 材料與方法

1.1 材 料

由北京農學院農業農村部華北都市農業重點實驗室培養的敏感系朱砂葉螨、EasyPure? RNA Kit、TransScript? One-Step gDNA Removal 和cDNA Synthesis SuperMix均購自于北京全式金生物技術有限公司；X5 High-Fidelity DNA Polymerase PCR Mix、M5 HiPer pTOPO-Blunt CloningKit、M5 HiPer Top10 Competent Cell購自北京聚合美生物科技有限公司；FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、FastPure Plasmid Mini Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司；TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)購自大連寶生物(Takara)公司。

1.2 朱砂葉螨幾丁質脫乙?；窽ecCDA5s基因的克隆

將10 mg朱砂葉螨放至1.5 mL離心管內，將其迅速放于液氮中約30 s，用電動研磨器充分研磨組織，參照EasyPure? RNA Kit說明書提取朱砂葉螨總RNA，對總RNA進行反轉錄生成cDNA。

根據前期獲得的朱砂葉螨轉錄組數據，在NCBI在線網址上找到高同源性物種二斑葉螨，參照其幾丁質脫乙?；富?，用Beacon Designer 7設計5′和3′引物進行同源克隆，由于TecCDA5b是TecCDA5a的剪切子，與TecCDA5a只差約100 bp，很難區分TecCDA5b和TecCDA5a，故TecCDA5b分段進行擴增，其引物序列參照表1。

表1 朱砂葉螨幾丁質脫乙?；傅幕驍U增引物Tab.1 Amplificationprimer of Tetranychus cinnabarinus chitinase genes

以朱砂葉螨cDNA為模板進行幾丁質脫乙?；傅臄U增(50 μL)，體系配置參照X5 High-Fidelity DNA Polymerase PCR Mix說明書。使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產物，并對產物進行純化。后使純化產物連接至TOPO載體上，72 ℃熱激轉化至Top10感受態細胞中，后提取其質粒送交上海生工生物公司進行測序。

1.3 朱砂葉螨幾丁質脫乙?；窽ecCDA5a、TecCDA5b、TecCDA5c基因特征分析

對基因序列進行開放閱讀框的推導；將朱砂葉螨CDAs的CDS區域翻譯成氨基酸序列后，將其氨基酸序列進行同源性比對；使用MEGA7.0構建系統發育樹的；使用Bootstrap=200的方法對結果數據進行計算；通過SMART在線網址和ProtScale進行蛋白功能域的預測和蛋白質疏水區的分析。

1.4 朱砂葉螨幾丁質脫乙?；窽ecCDA5s在不同發育時期的表達

1.4.1 提取朱砂葉螨不同發育時期的RNA及第一鏈cDNA合成 用細毛筆挑取約2 000頭生長狀況良好的朱砂葉螨雌成螨至一盆新鮮白蕓豆葉片上，讓其進行24 h的產卵，在體式顯微鏡觀察到大量的卵后將葉片上的雌成螨全部挑下。4 d左右朱砂葉螨由卵發育為幼螨，約6 d后發育為若螨，9～10 d后發育為成螨。將同一時間段的朱砂葉螨用細毛筆挑至0.02% 的吐溫20溶液中進行分離，使用不同目的篩子分別篩選出幼螨、若螨、成螨。過篩后清洗并晾干朱砂葉螨表面的水溶液，待螨可以活動后用細毛筆分別收集4個時期的螨至2 mL離心管中。使用EasyPure ? RNA Kit試劑提取各個時期的朱砂葉螨的RNA，并反轉錄合成cDNA。

1.4.2 實時熒光定量PCR 根據朱砂葉螨CDAs序列，設計TecCDA5s基因和內參基因β-actin 的引物，設計好的引物通過 ORCAE 在線軟件剔除可能產生干擾的引物，并對設計好的引物進行PCR驗證，選擇跑膠條帶較好的引物進行 RT-qPCR。引物見表 2。

表2 TecCDA5s熒光定量引物Tab.2 RT-qPCR primers of TecCDA5s

以得到的朱砂葉螨 4 個時期的 cDNA 為模板,熒光定量體系配置及程序參照TAKARA公司的TB Green ? Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)說明書。預變性：95 ℃，30 s；變性;95 ℃,5 s; 退火延伸：60 ℃,30 s; 40 個循環。試驗中每個樣本設置 3 次重復，同時設置2個陰性對照。使用△△Ct 法的程序，運用 2-△△Ct法計算其相對表達量，以Egg (卵)時期為參照，其相對表達量為1，采用單因素方差分析(ANOVA)和 Tukey's HSD 算法進行分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 朱砂葉螨幾丁質脫乙?；窽ecCDA5基因的克隆

對朱砂葉螨的轉錄組數據分析得到TecCDA5s的完整序列，根據其完整序列設計引物，通過PCR技術擴增得到了符合預期大小的TecCDA5a、TecCDA5b和TecCDA5c，基因如下圖1所示。由于TecCDA5b是TecCDA5a的剪切子，與TecCDA5a只差約100 bp，很難區分TecCDA5b和TecCDA5a，故TecCDA5b分三段進行擴增。

TecCDA5a、TecCDA5b、TecCDA5c全長分別為4 003 bp、3 901 bp、4 072 bp。其中TecCDA5a包含一個長度為3 915 bp的開放閱讀框，共編碼1 304個氨基酸，以5′端第40位開始的ATG為起始密碼子開始編碼蛋白，以TAA為終止密碼子，蛋白質分子量為142 925道爾頓。TecCDA5b包含一個長度為3 813 bp的開放閱讀框，共編碼1 270個氨基酸，以5′端第40位開始的ATG為起始密碼子開始編碼蛋白，以TAA為終止密碼子，蛋白質分子量為139 478道爾頓。TecCDA5c包含一個長度為4 059bp的開放閱讀框，共編碼1 352個氨基酸，以5′端第12位開始的ATG為起始密碼子開始編碼蛋白，以TGA為終止密碼子，蛋白質分子量為150 390道爾頓。將克隆得到的基因序列提交至NCBI數據庫得到登錄號分別為：MK813905、MN852245、MK813906。

2.2 朱砂葉螨幾丁質脫乙?；窽ecCDA5s氨基酸序列同源比對分析

將翻譯得到的TecCDA5s氨基酸在NCBI上使用Blast工具進行篩選，得到多組同源性高的其他物種的氨基酸序列，將得到的朱砂葉螨、二斑葉螨、赤擬谷盜的氨基酸序列軟件進行同源比對分析。分析結果如圖2所示，可以看出朱砂葉螨幾丁質脫乙?；概c二斑葉螨幾丁質脫乙?；傅陌被嵝蛄杏兄叨鹊耐葱?，朱砂葉螨TecCDA5a、TecCDA5b和TecCDA5c與二斑葉螨的同源性分別為98.86%、98.83%和98.97%，主要是結構域部分的氨基酸序列高度保守。

2.3 朱砂葉螨幾丁質脫乙?；傅鞍捉Y構域分析預測

通過SMART和NCBI在線工具CDD對朱砂葉螨幾丁質脫乙?；傅陌被嵝蛄羞M行蛋白結構域分析，得到圖3。分析結果表明TecCDA5a、TecCDA5b和TecCDA5c具有幾丁質結合結構域(ChBD)和多糖多乙?；呋Y構域(Polysaccharide deacetylase)，不具有低密度脂蛋白受體結合結構域(LDLa)。TecCDA5a、TecCDA5b在氨基酸N端第63位到117位均為幾丁質結合結構域，都包含約55個氨基酸；TecCDA5a的977～1 110位、TecCDA5b的 943～1 076位為多糖多乙?；呋Y構域，都包含約134個氨基酸，二者低復雜區域都為9個。TecCDA5c在氨基酸N端的100～154位為幾丁質結合結構域，共包含約55個氨基酸； 1 022～1 155位為多糖多乙?；呋Y構域，包含約134個氨基酸；而其低復雜區域較多，為11個。

2.4 分子進化樹構建

將朱砂葉螨幾丁質脫乙?；赴被嵝蛄型ㄟ^與NCBI上查找到的其他物種的幾丁質脫乙?；赴被徇M行同源性比較。從圖4可以看出，蜱螨目的二斑葉螨與TecCDA5c親緣關系最近，因此朱砂葉螨三個序列分別命名為TecCDA5a、TecCDA5b和TecCDA5c，且都屬于幾丁質脫乙?；富蚣易逯械腉roup Ⅳ。與赤擬谷盜、黑腹果蠅等相對遺傳距離相對較遠。

2.5 TecCDA5基因在朱砂葉螨不同發育時期的表達規律

將得到的數據通過2-△△Ct法計算朱砂葉螨不同發育時期相對表達量，結果用Origin軟件進行作圖，結果如圖5所示。

通過上圖分析可知朱砂葉螨幾丁質脫乙?；冈诼?、幼螨、若螨、成螨期的mRNA的豐度都有所不同。TecCDA5b作為TecCDA5a的剪切子，兩者只相差102 bp，難以找到合適的RT-qPCR引物,TecCDA5a+b的相對表達量結果表明TecCDA5s在朱砂葉螨生長的各個時期均有表達，但是表達量之間具有顯著性差異，說明其具有表達特異性。TecCDA5a+b和TecCDA5c都是在成螨時期表達量最高，在幼螨中的表達量最低，但是在卵中的表達量都要低于若螨；TecCDA5s的表達均呈現先下跌后升的趨勢。

3 討 論

幾丁質脫乙?；附陙聿砰_始被人們關注，其在昆蟲體內均參與幾丁質代謝[13]。由于幾丁質脫乙?；讣易鍞盗慷?，且未被發現的基因較多，無法完全弄清其相應的功能。目前研究最多的CDA1和CDA2與昆蟲的表皮形成有關，且都屬于GroupⅠ，對于其他家族的CDA了解還不夠深入[14]。

CDA5s屬于親水性蛋白，分析其蛋白結構域發現其氨基酸序列中只含有ChBD和多糖多乙?；呋Y構域，沒有LDLa，且都含有信號肽，可以引導蛋白質到達細胞含不同膜結構的亞細胞器內，使蛋白質得到充分加工。通過構建分子發育樹和同源比對分析，把TecCDA5s歸于Group Ⅳ。

目前研究表明赤擬谷盜TcCDA5a和TcCDA5b均主要在胴體中表達，TcCDA5a在胴體中特異性表達，而TcCDA5b在幼蟲的中腸中特異性表達[15]。肩突硬蜱等昆蟲的CDA5基因對其蛻皮無明顯影響，但在個別昆蟲體內發現其對圍食膜可能有一定的影響[16]。稻縱卷葉螟的CmCDA5則在表皮中表達量最高，可能參與其蛻皮，不同昆蟲的同一種CDA基因功能也存在著些許差異。

本試驗通過對TecCDA5s的時間表達水平進行了檢測，發現了其在朱砂葉螨不同生長發育時期的表達規律?？傮w來說其表達量有著相似性，但是又存在著些許的差異，這可能與其在分子層面上的差異有關。TecCDA5s均不含LDLa功能域，哺乳動物中含有多個低密度脂蛋白受體結合結構域他們負責結合并且轉運脂蛋白進入細胞中，從而參與膽固醇代謝[14]。而昆蟲體內低密度脂蛋白受體結合結構域可能參與脂蛋白的運輸，而脂蛋白同時又是表皮的重要組成成分，缺少這一結構域可能導致其不能參與脂蛋白的運輸過程，因而不影響昆蟲的表皮形成過程。且TecCDA5s控制蛻皮有關的TecCDA1和TecCDA2之間的表達量存在著顯著的差異，TecCDA1和TecCDA2均在卵時期的表達量最高或較高，而TecCDA5s在卵時期相對表達量較低，這說明了其功能上的差異及特異性，TecCDA5s在朱砂葉螨蛻皮過程中是否發揮作用還有待進一步探究。本試驗結果對朱砂葉螨幾丁質脫乙?；富蚣易宓难芯繑U充了相關數據，為基于靶向殺蟲基因的篩選深入研究打下基礎。