miR-22-3p/5p抑制小鼠成肌細胞增殖的功能研究

蓋 凱，叢百林，陳 鵬，齊曉龍，邢 凱，王相國，肖龍菲，

倪和民，郭 勇，楊佐君*，盛熙暉*

(北京農學院 動物科學技術學院，北京102206)

在骨骼肌生長發育過程中，肌肉前體細胞通過分裂增殖和細胞分化，成肌細胞的遷移、相互黏附與融合產生多核肌纖維，最后通過進一步分化形成骨骼肌。microRNAs(miRNAs)，一類非編碼核糖核酸，已被發現在動物骨骼肌發育過程中發揮重要作用，例如miR-378a、miR199a和miR-206等[1-3]。mmu-miR-22定位于小鼠11號染色體，其前體可以產生2個成熟miRNA，即分別從前體的5’和3’端加工而來的miR-22-5p和miR-22-3p。研究表明，miR-22-5p/3p是很多癌癥的診斷標記物,分別與急性心肌梗塞[4]、乳頭狀甲狀腺癌[5]、短暫性腦缺血[6]、卵巢癌[7]、肝癌[8]、膀胱癌[9]和非小細胞肺癌[10]等相關，但在骨骼肌發育過程中二者發揮的生物學功能尚不明確，具體的作用機制和調控網絡尚未徹底闡明。為了研究mmu-miR-22-3p/5p在骨骼肌細胞生長發育過程中的作用，選擇可以在低血清誘導條件下分化為多核肌管的小鼠成肌細胞(C2C12)作為細胞模型，通過轉染mmu-miR-22-3p/5p的模擬物，應用CCK-8法與流式細胞術兩種方法研究mmu-miR-22-3p/5p在小鼠成肌細胞在增殖過程中的作用，探究miR-22-3p/5p的生物學功能，目的是闡明miRNAs調控家畜骨骼肌生長發育的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

C2C12細胞購自于國家試驗室細胞資源共享平臺。mmu-miR-NC、mmu-miR-22-3p/5p模擬物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。轉染試劑脂質體Lipofectamine 2000和細胞裂解液Trizol均采購于美國Invitrogen公司。OPti-MEMI低血清培養基購自美國Gibco公司。細胞增殖-毒性檢測試劑盒 Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自北京索萊寶科技有限公司。實時熒光定量PCR試劑購自北京寶日醫生物技術有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 C2C12細胞培養、總RNA提取和實時熒光定量PCR C2C12細胞培養于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中，置于溫度37 ℃、含5% CO2的培養箱中培養。在細胞增殖的第2、3、4 天收集細胞，加入800 μL Trizol，樣品裂解后加氯仿，分層后提取細胞總RNA，每個時間點設置3 個重復。加入1 μL buffer 電泳檢測RNA完整性，利用紫外分光光度計測定純度和濃度，當A260/A280比值為1.9～2.1時說明RNA的濃度和純度合格。利用實時定量PCR技術檢測mmu-miR-22-3p/5p在C2C12細胞增殖的過程中表達的情況增殖的過程中表達的情況，以U6作為內參基因，引物序列為：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；mmu-miR-22-3p 的引物序列為5′-AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGT-3′和5′-TGCAGGTCAACTGGTGTCGT-3′；mmu-miR-22-5p的引物序列為5′-AGTTCTTCAGTGGCAAGCTTTA-3′和5′-TGCAGGTCAACTGGTGTCGT-3′。退火溫度為60 ℃，所有反應均設置3個復孔和3次技術重復，采用2 -△△Ct法計算相對表達量。

1.2.2 細胞轉染 將處在對數生長期的C2C12細胞接種至6 孔的細胞培養板中，密度為1×105個/孔。轉染前1 d，將培養基更換為不含血清的高糖DMEM，使轉染時的細胞密度達65% ～ 70%。24 h后，按照lipofectamine 2000說明書對細胞進行轉染。首先用OPti-MEMI分別稀釋mmu-miR-NC、mmu-miR-22-3p/5p模擬物和lipofectamine 2000，混勻后離心。將二者充分混勻后制為50 nm的轉染劑，室溫靜置。將培養基換為含10 %血清的高糖DMEM，逐滴緩慢加入轉染試劑，將其置于培養箱中培養6 h。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖 將含有10 %FBS的高糖DMEM培養基加入96 孔板中，用轉染mmu-miR-NC或者mmu-miR-22-3p/5p模擬物后的C2C12細胞鋪板，細胞密度為1×103個/孔。每隔24 h將待測孔培養基更換為不含有血清的高糖DMEM并加入CCK-8試劑(10∶1)，培養基與試劑充分混勻后，將板放入37 ℃、5 % CO2的培養箱中培養2 h。2 h后取出96孔板并使用錫紙避光，使用多功能酶標儀450 nm檢測待測時間(24、48、72、96 h)的OD值，得到結果后繪制曲線圖。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期 將C2C12細胞轉移至6孔細胞培養板中，每孔加入含有10 %FBS的高糖DMEM培養基，轉染mmu-miR-NC或者mmu-miR-22-3p/5p模擬物(1×105個/孔)。轉染30 h后收集細胞，加入1 mL預冷PBS溶液洗滌兩次后離心4 min(1 000 r/min)，棄其上清液；加入1 mL預冷的75 %乙醇，于4℃下固定4 h以上，離心5 min(1 000 r/min)后棄上清液。再用3 mL預冷PBS洗滌2次后加入0.5 mL的PL溶液染色，混勻后使用流式細胞儀480 nm激光對紅光通道熒光信號進行檢測，細胞周期百分比利用MODifitLT軟件進行分析。

使用SPASS 25.0的單因素方差分析進行統計學分析，結果以“平均數±標準差”表示。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 C2C12細胞增殖過程mmu-miR-22-3p/5p的表達情況

利用qRT-PCR方法檢驗mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p在增殖期C2C12細胞中的表達情況。結果表明，mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p均有表達，其中mmu-miR-22-3p在C2C12細胞中第3天表達量降低，但差異不顯著；第4天表達量顯著升高(P<0.05)(圖1-A)。mmu-miR-22-5p在C2C12細胞中表達逐步升高，在不同時間點的表達量差異均顯著(P<0.05)(圖1-B)。

2.2 利用CCK-8法檢測mmu-miR-22-3p/5p對C2C12細胞增殖的影響

將轉染mmu-miR-22-3p/5p模擬物和mmu-miR-NC的C2C12細胞鋪板于96孔板中，分別在24、48、72、96 h應用多功能酶標儀檢測450 nm波長下的OD值。結果如圖2所示，轉染mmu-miR-22-3p模擬物組的OD值在24、48、72、96 h時均極顯著低于mmu-miR-NC對照組(P<0.01)(圖2-A)；轉染mmu-miR-22-5p模擬物組的OD值在24 h顯著低于mmu-miR-NC對照組(P<0.05)，72 h極顯著低于mmu-miR-NC對照組(P<0.01)(圖2-B)，即轉染mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p對C2C12細胞的增殖過程具有不同程度的抑制作用。

2.3 利用流式細胞術檢測細胞周期

轉染mmu-miR-22-3p/5p模擬物和mmu-miR-NC 30 h后，收集C2C12細胞。用75 %乙醇固定、PL染色液染色后在4 ℃避光孵育30 min，使用流式細胞儀480 nm檢測細胞周期。結果如圖3所示，轉染mmu-miR-22-3p模擬物組中處于G0G1期的細胞數極顯著高于對照組(P<0.01)；處于G2M期和S期的C2C12細胞數低于對照組，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)(圖3A)。轉染mmu-miR-22-5p模擬物組中處于G0G1期和G2M期的細胞數顯著高于對照組(P<0.05)；處于S期的C2C12細胞數量低于對照組，但差異不顯著(圖3-B)。結果表明，在C2C12細胞中過表達的mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p均使細胞在增殖過程中于S期受到阻滯，與對照組相比增殖能力降低。

3 討 論

動物骨骼肌在維持其機體正常功能中發揮著重要作用，更與畜禽動物的產肉性能和生產效率息息相關，因此挖掘畜禽動物骨骼肌生長發育的調控基因、解析其遺傳機制意義重大。骨骼肌細胞的發育過程復雜，包括體節細胞和成肌細胞的增殖、分化、遷移等環節，最終使得肌管成熟形成不同類型的肌纖維，其中涉及到眾多遺傳因子的網絡式調控以及基因表達。目前，已經發現了調控骨骼肌細胞發育的若干主效基因，例如轉化生長因子β超家族(TGF-β)促進TGFBR的表達從而調控骨骼肌細胞的增殖及分化[11]；肌細胞增強因子2家族(MEF2)可調控成肌細胞分化的高低[12]；生肌調節因子家族(MRFs)控制重要的肌肉特異性蛋白質(如肌球蛋白重鏈和肌肉肌酸激酶)的轉錄[13]等，但有關骨骼肌生長發育的分子機制尚未被完全闡明。miRNAs作為遺傳通路里的微調基因或控制開關，已有眾多研究結果表明miRNAs能夠對骨骼肌的增殖與分化等過程進行調控。例如miR-1、miR-206和miR-133等被稱為肌肉特異性miRNA，可以在骨骼肌和心肌組織中特異表達。其中，miR-1[14]與miR-206[15]均可促進組蛋白去乙?；?(HDAC4)的靶基因表達，進而調控肌肉分化；miR-133通過調控MAML1和IGF-1R等靶基因的表達在成肌細胞的增殖過程發揮作用[16-17]。miRNAs除了能夠調節骨骼肌細胞的增殖之外，研究發現還可以通過調控靶基因表達促使骨骼肌細胞的凋亡等過程。例如miR-16可以靶向抑制因子Foxo1和基因Bcl2的轉錄，調控骨骼肌細胞的凋亡[18]。雖然miRNA在骨骼肌細胞的研究成果顯著，但是調控骨骼肌生長發育的miRNA網絡仍然有待完善。

大量研究表明，miR-22-3p可在不同的癌癥以及其他疾病中發揮生物學功能。在患有卵巢早衰的患者中，miR-22-3p的表達水平顯著低于對照組[19]；miR-22-3p可通過下調亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)的表達，在葉酸缺乏引起的肝癌細胞中發揮作用[20]；miR-22-3p及其靶基因eIF4E結合蛋白基因(eIF4EBP3)之間的相互作用可用于靶點改善臨床子宮頸癌的治療[21]；miR-22-3p通過靶向調節細胞因子信號轉導抑制因子3 (Socs3)的表達抑制妊娠期糖尿病小鼠肝臟胰島素抵抗的發生[22]。另有研究發現miR-22-3p，可通過靶向結合刺激蛋白1基因(SP1)來抑制其下游G1/S-特異性周期蛋白-D1基因(CCND1)和B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(BCL2)基因的表達，抑制肝癌細胞(HCC)增殖并誘導細胞凋亡[23]；miR-22-3p通過調控Onecut 1(OC1)/血管內皮生長因子A (VEGFA)信號通路抑制內皮祖細胞增殖和遷移[24]。本次研究結果表明，miR-22-3p可抑制小鼠成肌細胞增殖，提示miR-22-3p可在多種細胞類型中抑制細胞增殖過程，為今后miR-22-3p的生物學功能研究提供了理論參考。

miR-22-5p被認為是心血管疾病和癌癥的候選生物標志物。研究發現，在急性心肌梗死患者的血漿中，miR-22-5p的表達發生了顯著變化，被認為是急性心肌梗死的潛在生物標志物[25-27]；miR-22-5p上調可抑制棒狀體相關蛋白1癌基因家族成員/細胞外調節蛋白激酶(RAP1/ERK)信號通路，從而保護心肌[28]。本研究結果表明，miR-22-5p可在成肌細胞增殖的過程中起到負調節作用，該結果對于miR-22-5p的生物學功能研究是一個重要的補充，同時為骨骼肌生長發育的miRNA調控機制提供了新的見解。但是，miR-22-3p/5p抑制成肌細胞增殖的具體調控機制尚不明確，需要通過更全面的體外或體內試驗進一步研究。

本研究結果表明，mmu-miR-22-3p和mmu-miR-22-5p可不同程度的抑制小鼠成肌細胞的增殖，豐富了miR-22的生物學功能認知，為今后動物肌肉發育的分子育種研究提供了理論基礎。