不同香型再造煙葉濃縮液化學成分和微生物組差異性研究

黃申，閆美玲，蘆堯，田泱源，毛多斌，蘆昶彤，陳芝飛，馮穎杰

1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.河南卷煙工業煙草薄片有限公司，河南 許昌 461000；3.河南中煙工業有限責任公司 技術中心，河南 鄭州 450000

0 引言

煙草薄片是卷煙工業的重要原料，再造煙葉濃縮液(以下稱濃縮液)作為煙草薄片的主體成分，提高其品質具有重要價值[1-2]. 目前，對煙草薄片常規化學成分及致香成分多有研究報道[3-5]，形成了系統的標準及檢測方法，然而，對不同香型再造煙葉濃縮液化學成分差異進行的系統研究則相對較少.

近年來，采用高通量測序技術研究煙草微生物群落結構已有報道. R.E.Tyx等[6]研究了干鼻煙、濕鼻煙等煙草制品中微生物的多樣性和分類豐度，共鑒定出來自放線菌門、厚壁菌門、變形菌門等的33菌屬；B.B.Hu等[7]采用高通量測序方法系統研究了煙葉在烤制過程中微生物種群的變化，發現細菌群落的組成較簡單且優勢種群占比較高，而真菌的多樣性明顯優于細菌，且種群更穩定.舒明等[8]對生產過程中的煙葉水提液進行了高通量測序，發現煙葉水提液中細菌種群組成非常豐富，其優勢菌屬是乳桿菌屬(Lactobacillus)和賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus). 陳澤斌等[9-10]研究發現,煙草組織中有豐富的微生物，且芽孢桿菌屬細菌是其優勢種群. H.G.Liu等[11]為研究煙葉濃縮液細菌群落結構，對煙葉濃縮液進行了焦磷酸測序，發現濃縮液中優勢屬為乳桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬和假單胞菌屬(Pseudomonas). 王沖等[12]通過18S rDNA和16S rDNA測序發現,再造煙葉濃縮液微生物真菌種群的豐富度和多樣性低于細菌. 但目前尚未發現不同香型再造煙葉濃縮液中微生物對比分析的相關報道.

鑒于此，本文擬對濃香型、中間香型和清香型3種香型再造煙葉濃縮液的化學成分、中性香味成分及微生物組進行研究，通過連續流動法測定其常規化學成分，采用GC-MS法檢測其中性香味成分，并通過高通量測序分析其微生物組，以期揭示不同香型再造煙葉濃縮液化學成分及微生物組差異.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：濃香型再造煙葉濃縮液(以下簡寫為濃香型濃縮液)、中間香型再造煙葉濃縮液(以下簡寫為中間香型濃縮液)、清香型再造煙葉濃縮液(以下簡寫為清香型濃縮液). 不同香型煙葉原料均由河南卷煙工業煙草薄片有限公司提供，濃縮液制備工藝如下：將不同香型煙末、煙梗，分別和水以固液比1∶4的比例混合，在50 ℃條件下浸提，用擠干機擠出水萃液，濃縮成干物質量為40%、波美度為25 °Bé、密度為1.22 g/cm3的不同香型濃縮液.

主要試劑：二氯甲烷(色譜純)，購自天津市凱通化學試劑有限公司.

主要儀器：Agilent 6890a/5975c型GC-MS色譜聯用儀，美國Agilent公司產；J6-MI型冷凍離心機，美國Beckman公司產；San+連續流動分析儀，荷蘭Skalar公司產.

1.2 實驗方法

1.2.1 常規化學成分檢測常規化學成分主要包括氯、水溶性總糖、總植物堿、總氮和鉀，其含量測定按煙草行業標準(連續流動法)進行測定[13-17].

1.2.2 中性香味成分檢測取濃縮液樣品20.5 mL置于1000 mL的圓底燒瓶中，加入500 mL的水和沸石，同時蒸餾萃取150 min，獲得二氯甲烷萃取液約80 mL，參考黃申等[18]的方法對濃縮液的中性香味成分進行提取，并采用GC-MS法進行分析.

1.2.3 濃縮液16SrDNA和ITSrDNA序列測序取濃縮液樣品于10 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，收集菌體細胞沉淀后送上海生工生物工程股份有限公司測序，流程如下.

1)Illumina測序：Illumina MiseqTM/HiseqTM測得的圖像經堿基識別分析轉化為原始測序序列.

2)數據預處理：使用cutadapt去除Miseq測序時添加的引物接頭；根據PE reads之間的overlap關系使用PEAR將成對reads拼接成一條序列；從拼接后數據中分割出各樣本數據并校正序列方向；使用PRINSEQ切除reads尾部低質量值堿基.

3)OTU聚類：提取各樣本優化序列中的非重復序列(不含單序列)；16S使用Blast比對GTDB數據庫；ITS使用Blast比對UNITE數據庫，按照97%相似性對非重復序列進行OTU聚類，在分類學水平上統計各樣本的群落組成；基于OTU聚類分析結果，對OTU進行多樣性指數分析，包括PCA分析、物種分布韋恩圖分析、相對豐度分析.

2 結果與討論

2.1 常規化學成分分析

不同香型濃縮液常規化學成分質量分數如表1所示. 由表1可知，清香型、中間香型和濃香型濃縮液水溶性總糖質量分數不同，其中清香型最高，為9.6%，中間香型次之，濃香型最低，為9.2%. 濃香型的總植物堿、氯、總氮質量分數較高，分別為1.2%、0.7%、1.6%，中間香型和清香型較低，分別為1.1%、0.6%、1.5%，這與已有研究結果[4-6]大致相同. 濃香型和清香型濃縮液鉀質量分數均為2.8%，中間香型為2.7%. 總體看來，不同香型濃縮液常規化學成分間的差異符合不同香型煙葉化學成分的差異，這種差異是由于原料的差別導致的.

表1 不同香型濃縮液常規化學成分質量分數Table 1 Mass fraction of conventional chemical components in different flavor concentrates %

2.2 中性香味成分分析

采用歸一化法對清香型、中間香型和濃香型濃縮液離子流進行分析，得到不同香型濃縮液中性香味成分結果(見表2). 由表2可知，中間香型濃縮液的香味成分種類最多，濃香型次之，清香型最少；2-乙?；秽珒H在濃香型濃縮液中檢出，但質量濃度較少，為0.418 μg/mL；法尼基丙酮僅在清香型濃縮液中檢出且質量濃度較高，為11.395 μg/mL.清香型濃縮液中α-大馬酮和二氫獼猴桃內酯質量濃度較高，分別為5.279 μg/mL和3.218 μg/mL，中間香型和濃香型較少；巨豆三烯酮和金合歡醇質量濃度差異最顯著，清香型濃縮液中分別為22.476 μg/mL和0.777 μg/mL，中間香型濃縮液分別為13.776 μg/mL和0.349 μg/mL，濃香型濃縮液中的分別為11.135 μg/mL和0.364 μg/mL，這兩種香味物質在清香型濃縮液中的質量濃度是其他香型濃縮液的近2倍；濃香型濃縮液中芳樟醇和2-乙?；量┵|量濃度最高，分別為0.285 μg/mL和2.745 μg/mL，中間香型次之，清香型最低，這與已有研究結果[3]大致相同.

表2 不同香型濃縮液中性香味成分表Table 2 Neutral aroma components of different flavor concentrates

2.3 微生物組分析

2.3.1Illumina測序分析將濃香型、中間香型和清香型濃縮液3種樣品的Illumina測序原始數據上傳到NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)，其SRA號分別為SRR14936429、SRR14993896和SRR14936360，經過denovo注釋獲得了不同香型濃縮液中微生物的有效序列數(見表3).由表3可知，3種濃縮液細菌微生物序列數呈現差異，其中清香型濃縮液中細菌微生物有效序列數最多，為94 533，濃香型次之，中間香型最少；真菌序列數呈現差異顯著，其中中間香型中真菌微生物有效序列數最多，為108 666，清香型次之，濃香型最少.

表3 不同香型濃縮液中微生物有效序列數Table 3 Number of effective sequence strips in different flavor concentrates

2.3.2OTU聚類分析對OTU代表序列采用GTDB數據庫和UNITE數據庫進行聚類分析，結果見表4.由表4可知，3種香型濃縮液中共測得芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬、伯克氏菌屬(Burkholderia)、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、土地芽胞桿菌屬(Terribacillus)6個細菌屬類，酵母菌屬(Issatchenkia)，假絲酵母菌屬(Candida)，季也蒙酵母屬(Meyerozyma)、鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillaceae)、紅酵母屬(Rhodotorula)、短梗霉屬(Aureobasidium)、須腹菌屬(Rhizopogon)等11個真菌屬類. 3個樣品所共有的菌屬有8個，主要有2個優勢屬類，分別是芽孢桿菌屬和乳酸桿菌屬. 結果表明，清香型濃縮液中的細菌多樣性最大，中間香型次之，濃香型最??；濃香型濃縮液中的真菌多樣性最大，中間香型次之，清香型最小.

表4 不同香型濃縮液OTU聚類結果Table 4 Results of OTU cluster of different flavor concentrates

2.3.3PCA物種相似度分析為分析不同香型濃縮液微生物群落組成之間的差異和距離，運用方差分析，將樣品菌屬的差異反映在二維坐標圖上(坐標軸為能最大限度反映樣品間差異的兩個特征值)濃縮液中細菌微生物和真菌微生物PCA分析圖，如圖1所示. 樣品的菌屬多樣性越相似，圖中距離越近.由圖1a)可知，清香型與中間香型距離較近，而與濃香型之間距離較遠，說明清香型與中間香型濃縮液之間細菌多樣性相似度較大，而與濃香型濃縮液之間細菌多樣性相似性較??；由圖1b)可知，清香型和濃香型距離較近，而與中間香型濃縮液之間距離較遠，說明清香型和濃香型真菌多樣性相似度較大，而與中間香型濃縮液之間相似性較小.

圖1 濃縮液中細菌微生物和 真菌微生物PCA分析圖Fig.1 PCA diagram of bacterial and fungal in the concentrates

2.3.4 物種分布韋恩圖分析為統計不同香型濃縮液中共有的和獨有的OUT微生物群落，分析OTU數目組成相似性及重疊情況，繪制物種分布韋恩圖(見圖2). 由圖2a)可知，3種濃縮液共有細菌菌屬為67種，清香型和中間香型共有47種，清香型和濃香型共有1種，中間香型獨有細菌菌屬最多，為59種，清香型次之，為21種，濃香型最少，為3種；由圖2b)可知，3種濃縮液共有真菌菌屬9種，中間香型和濃香型共有54種，中間香型和清香型共有7種，未檢到清香型和濃香型共有真菌菌屬，濃香型獨有真菌菌屬最多，為104種，中間香型次之，為28種，清香型最少，為1種.

圖2 濃縮液中細菌微生物和 真菌微生物OTU分布韋恩圖Fig.2 Venn diagram of bacterial and fungal OTU distribution in the concentrates

2.3.5 相對豐度分析為研究不同香型濃縮液的微生物豐度，確定優勢菌屬，進行相對豐度分析，結果見圖3. 由圖3a)可知，濃香型、中間香型和清香型3種濃縮液主要有兩個優勢細菌屬類：芽孢桿菌屬和乳桿菌屬.其中，中間香型相對豐度最高，占比77.59%，清香型次之，占比73.62%，濃香型最低，占比57.61%；乳桿菌屬在濃香型中相對豐度最高，占比41.76%，清香型次之，占比23.1%，中間香型最低，占比16.76%；其他菌屬相對豐度很低. 由圖3b)可知，3種濃縮液中真菌微生物相對豐度呈現顯著差異，濃香型的優勢菌屬類為多型漢遜酵母菌屬(Ogataea)和酵母菌屬，相對豐度分別為48.25%和15.38%；中間香型的優勢菌屬類為德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)和假絲酵母菌屬，相對豐度分別為48.81%和49.08%；清香型的優勢菌屬類為德巴利氏酵母屬，相對豐度為99.79%. 對濃縮液中微生物群落結構分析已經發現，其優勢細菌菌屬為乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、鏈球菌屬(Streptococcus)和假單胞菌屬，優勢真菌菌屬為釀酒酵母屬(Kazachstania)和假絲酵母菌屬[8,11-12]，這與本文研究結果大致相同. 綜上所述，濃香型、中間香型和清香型濃縮液樣品中有相當數量的共有微生物種群，其中細菌微生物種群大致相同，真菌微生物種群差異較大.

從屬水平上分析樣品微生物群落組成，發現芽孢桿菌屬和乳桿菌屬均屬于厚壁菌門，多型漢遜酵母菌屬和德巴利氏酵母屬均屬于子囊菌門，其中乳酸桿菌能夠利用糖產生乳酸，芽孢桿菌能產生芽孢，酵母菌發酵醇化濃縮液，它們都可以適應濃縮液高糖、高滲透壓的環境，且在不同香型濃縮液中的分布各不相同.3種樣品中，水溶性總糖含量較高的濃縮液乳酸桿菌相對豐度較低，芽孢桿菌相對豐度較高，說明乳酸桿菌屬細菌和芽孢桿菌屬細菌對不同香型煙葉濃縮液環境表現出不同的耐受力. 可能的原因是乳酸桿菌屬細菌利用糖產生乳酸，受代謝產物的抑制數量較少，相反，芽孢桿菌屬細菌能夠通過形成芽孢成功地適應環境，因此在清香型和中間香型濃縮液中呈現明顯的數量優勢. 3種不同香型濃縮液中水溶性糖含量越高，濃縮液中芽孢桿菌相對豐度越高，巨豆三烯酮、2-乙?；秽吭礁? 這可能是由于濃縮液中芽孢桿菌越多，微生物利用再造煙葉濃縮液中類胡蘿卜素、還原糖、氨基酸產生香味物質的數量越多、品質越好，因此清香型中性香味成分的數量和質量呈現明顯優勢. 已有研究[19-20]也發現，芽孢桿菌屬微生物具有類似的功能.

3 結論

本研究運用連續流動法對不同香型濃縮液常規化學成分含量進行對比，發現清香型濃縮液中水溶性總糖質量分數較高，濃香型濃縮液中總植物堿、氯和總氮質量分數較高，中間香型濃縮液中常規化學成分質量分數大多在兩者之間. 利用GC-MS法對不同香型濃縮液中性香味成分進行檢測，發現清香型濃縮液α-大馬酮、二氫獼猴桃內酯、巨豆三烯酮和金合歡醇的質量濃度較高，濃香型中芳樟醇和乙?；量┵|量濃度較高，中間香型中性香味成分種類最多，質量濃度大多在清香型與濃香型之間. 利用高通量測序對不同香型濃縮液中細菌和真菌群落結構和多樣性進行分析，發現清香型濃縮液中細菌物種多樣性最大，濃香型真菌物種多樣性最大；3種樣品的優勢細菌菌屬均為芽孢桿菌屬和乳酸桿菌屬，濃香型的優勢真菌菌屬類為多型漢遜酵母菌屬和酵母菌屬，中間香型和清香型為德巴利氏酵母屬.該研究能夠為我國不同香型風格再造煙葉濃縮液的生物處理及利用研究提供理論參考.