細胞穿膜肽S4(13)與質膜相互作用的分子動力學模擬*

高金愛，崔巍

(中國科學院大學化學科學學院， 北京 101408)

在藥物研發過程中，許多潛在的藥物由于跨膜性質不佳而被淘汰，因此，藥物跨膜能力是藥物開發過程中必須考慮的重要因素[1-3]。細胞穿膜肽是一類序列長度小于30個氨基酸的短肽，可以穿過細胞膜而不對細胞造成損害，因此可以作為載體將藥物、核酸和蛋白質等生物活性分子轉運到細胞中[4-9]，從而使活性分子更好地發揮作用。近年來，細胞穿膜肽作為潛在的藥物遞送載體已經引起人們的廣泛關注，探究細胞穿膜肽的作用機理對細胞穿膜肽的臨床應用研究具有重要意義。

S4(13)是從螺旋抗菌肽Dermaseptin S4中截取出來的一段細胞穿膜肽(圖S1)，它由13個氨基酸殘基(ALWKTLLKKVLKA)構成，其中的Lys氨基酸殘基使S4(13)整體帶正電。研究表明S4(13)經過核定位信號肽修飾之后，可以參與腫瘤細胞中siRNA的遞送過程和實現基因沉默，同時具有對細胞毒性低的優點[9-14]。已有的實驗數據證明S4(13)能夠進入細胞[13]，它的穿膜特點決定了它的衍生物具有遞送核酸的作用，但是，關于S4(13)穿膜的具體機理尚不清楚[15]。目前的研究中只有S4(13)修飾后的產物S4(13)-PV穿膜的相關報道，即Mano等通過抑制內吞途徑的實驗，發現S4(13)-PV進入細胞的過程并沒有受到影響，證明了S4(13)-PV的穿膜過程普遍是非內吞的作用機制[16]，并且他們用實驗說明了S4(13)-PV是以直接易位的方式進入細胞膜，細胞膜的組分會對穿膜過程產生影響[16-17]。Padari等[18]通過圓二色譜法發現S4(13)-PV會組裝成特定大小和形狀的聚集體。雖然現有實驗支持S4(13)直接易位的作用機制，但是目前還不清楚S4(13)是以單分子形式還是以聚集體的形式穿膜。

本文使用分子動力學模擬[19-20]的方法研究細胞穿膜肽S4(13)與質膜的相互作用，用1-棕櫚?；?2-油?；字Ｄ憠A(POPC)和1-棕櫚?；?2-油?；字８视?POPG)2種磷脂分子搭建的雙分子層分別代表真核生物質膜和原核生物質膜，對單個和多個S4(13)分子在單純水相和水膜兩相的環境下分別進行常規分子動力學模擬，通過傘形采樣模擬單個多肽分子在膜上的吸附和擴散以及多個多肽分子在水溶液中的聚集過程，并尋找多肽和質膜作用過程中涉及的關鍵殘基，以此為穿膜肽跨生物膜運輸活性分子的研究提供理論參考，幫助設計更理想的細胞穿膜肽。

1 研究方法

1.1 構建分子動力學模擬體系

本項工作用到的細胞穿膜肽S4(13)的結構(圖S1)來自于穿膜肽數據庫CPPsite2.0[21-23]，該結構具有兩親性，疏水性氨基酸和親水性氨基酸分別分布在螺旋兩側；分別以POPC和POPG構造質膜模型，以模擬真核和原核生物細胞膜[24]。磷脂分子POPC和POPG的結構從PubChem數據庫[25]中獲取。使用Gaussian 09[26]選擇HF/6-31 G*方法和基組建立磷脂分子的GAFF力場[27]參數，步驟包括：首先對磷脂分子進行結構優化，然后利用Amber 18[28]中的antechamber程序計算每個原子的RESP靜電荷[29-30]，最后利用parmchk2程序補充相關的力場參數。完成磷脂分子力場參數的構建之后，用Packmol[31]和Amber 18軟件的tleap程序分別搭建如表1所示8個體系的起始結構，根據Packmol盒子的大小和磷脂分子以及水分子的密度確定每個體系中磷脂分子和水分子的個數。分別用S1～S8表示本文中8個常規分子動力學模擬的體系(S1～S3體系用于分析單個多肽的性質，S4～S8用于分析多個多肽的性質)。S4～S6體系中，5個多肽分子在空間上分布較遠，S7體系中5個多肽分子分布較緊密，S8體系中4個多肽分子來自于S7體系平衡后的聚集體結構。

表1 常規分子動力學模擬的體系Table 1 System list of classical MD simulations

1.2 常規分子動力學模擬

所有的動力學模擬和分析均使用Amber 18軟件包進行。S4(13)采用Amber ff14SB力場[32]，磷脂分子采用GAFF力場，所有的水分子都采用TIP3P水[33]。用tleap程序為其添加抗衡離子以及周期邊界盒子，生成動力學模擬所需要的拓撲文件和坐標文件，最終進行相應時長的分子動力學模擬。每個體系進行分子動力學模擬之前，首先經歷3步優化的過程除去體系中的不合理原子接觸和碰撞，釋放初始結構中不合理因素帶來的張力，達到勢能面較平穩的狀態：1) 約束多肽，有質膜的體系同時約束磷脂分子，優化除此之外的水分子和抗衡離子；2) 約束多肽的骨架原子，有質膜的體系對磷脂分子的頭尾原子進行約束，對多肽側鏈以及其他組分進行優化；3) 不加任何約束進行優化。這3步優化都是先采用最陡下降法，后采用共軛梯度的方法進行優化。之后，每個體系在NPT系綜條件(壓力設置為100 kPa)下經歷7步升溫過程，將體系從0 K均勻地加熱到310 K，無質膜的體系經歷500 ps的升溫過程，有質膜的體系經歷1 ns，直至體系密度達到平穩。對每個平穩后的體系在NVT系綜條件下進行如表1所示相應時長的分子動力學模擬，模擬步長設置為2 fs，軌跡每隔1 ps寫入一次，用Berendsen thermostat恒溫熱浴方法控制溫度維持穩定在310 K附近，用SHAKE算法[34]約束含氫共價鍵的伸縮振動，將長程相互作用的截斷值設置為1.0 nm，使用particle mesh Ewald (PME)方法[35]處理分子模擬中的長程靜電相互作用。

1.3 傘形采樣分子動力學模擬

為說明單個S4(13)分子在不同質膜上的吸附和擴散行為，應用傘形采樣方法將S4(13)分子分別從POPC和POPG質膜中心沿著垂直于質膜平面的z軸方向拉到距離質膜中心6 nm的位置處，定義質膜中心和多肽分子質心的距離作為反應坐標。設置傘形采樣窗口數為61，每個采樣窗口的寬度設為0.1 nm，施加外力的力常數大小設置為1 046 kJ/(mol·nm2)，每個采樣窗口模擬的時間為10 ns。對每個采樣窗口，分子動力學模擬的步長都設置為2 fs，每隔2 ps寫入一次軌跡，在310 K溫度條件下進行模擬。另外，為說明多個S4(13)分子在水相中發生聚集的趨勢，對S8體系中聚集體的穩定結構，施加外力將其中一個S4(13)分子從其他3個S4(13)分子的質心位置沿著遠離聚集體的方向拉到距離質心3 nm的位置，定義被拉的S4(13)分子的質心和另外3個S4(13)分子的質心的距離作為反應坐標，設置傘形采樣的窗口數為26，其他模擬條件與S4(13)在質膜上所進行的傘形采樣模擬條件一致。最后，使用加權柱狀圖分析方法通過Wham程序[36-37]計算這3組傘形采樣動力學模擬過程中的自由能，繪制平均力勢(potential of mean force, PMF)曲線。

1.4 分子動力學軌跡分析

各個體系的動力學軌跡分析都由Amber 18軟件包中的cpptraj程序[38]完成。包括多肽骨架原子均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)的計算、氫鍵的統計(采用cpptraj默認的氫鍵標準)、二級結構的統計、回轉半徑(radius of gyration，Radgyr)的計算、質量密度的計算、相關系數的計算、接觸強度的計算以及特定幀結構的提取。

2 結果與討論

2.1 軌跡分析判斷體系的穩定性

各個體系升溫過程中的密度變化(圖S2)反映了密度在升溫過程中都已達到平衡。S4(13)骨架原子均方根偏差(RMSD)的計算結果(圖S3)表明每個體系在動力學軌跡最后150 ns都已經達到穩定和平衡。為使每個體系有足夠的采樣，每個體系進行一定長時間的分子動力學模擬后，均選用最后150 ns軌跡進行各種性質的統計與分析。RMSD數據還提示含有單個S4(13)分子的體系S1～S3的RMSD較小，含有多個S4(13)分子的體系S4～S7的RMSD較大且相互存在差異：S5和S7體系的RMSD值穩定在1 nm左右，說明S4(13)可能維持結合狀態，受到比較穩定的相互作用；而S4和S6體系的RMSD穩定在4 nm左右，可能是因為體系中有靈活性比較大的多肽分子。

2.2 單個S4(13)分子與不同質膜相互作用對比

統計最后150 ns動力學軌跡中，S2和S3體系中磷脂親水端、磷脂疏水端、磷原子、水分子和S4(13)分子在垂直于質膜雙層平面法線方向的質量密度分布和不同殘基的Cα原子與磷原子平面的距離(圖1)，用來描述多肽整體和各個殘基在多肽結合到質膜表面時相對于質膜的位置。密度分布圖(圖1(a)、1(b))中，為方便觀察，將質膜的重心位置定義為Zposition=0，考慮到S4(13)的密度遠小于其他組分，其密度使用右側坐標軸，比例尺為其他組分密度的1/5。S4(13)的密度分布越靠近質膜，說明肽與質膜的作用越強；殘基的Cα原子和磷原子平面的距離越小，提示該殘基越靠近質膜，說明這個殘基參與肽與質膜相互作用的可能性更大。結果表明S4(13)和POPG膜有更強的相互作用，這歸因于POPG膜體系的磷脂分子帶負電，可以和帶正電的S4(13)分子形成較強的靜電相互作用。

圖1 沿z軸方向體系S2、S3各組分的密度分布圖和各個殘基的Cα原子距離磷原子平面的距離圖Fig.1 The mass density distribution map of the components and the distance between Cα atoms of each residue and average plane of phosphorus atoms along z direction in systems S2 and S3

通常2層磷脂親水頭部間的距離可以用于描述質膜的厚度，密度分布圖表明S4(13)分子對POPG膜和POPC膜厚度的影響可以忽略不計。隨著模擬的進行，2個體系S4(13)分子的質量密度(圖(1(a)、1(b))，橙色區域)都集中分布在水相和質膜親水端區域內，說明S4(13)分子與2種質膜都有作用。但是，S2體系的S4(13)分子在垂直于POPC膜平面方向上密度分布更廣，S3體系的S4(13)分子在垂直于POPG膜平面方向上密度分布更集中，說明S4(13)分子在POPC膜體系中有較大的運動自由度，在POPG膜中運動受到限制。

圖1(c)表明S4(13)在POPC膜中只有多肽鏈N-端的3個氨基酸殘基Ala-1、Leu-2和Trp-3靠近了磷原子平面，與質膜的親水端形成相互作用；圖1(d)表明在POPG膜體系中，S4(13)的兩端和質膜都有作用，其中Ala-1、Lys-12和Ala-13是距離磷原子平面最近的3個殘基；S4(13)中間部分的Lys-4和Lys-9殘基也和質膜有作用。綜上，與POPC膜有作用的主要是疏水性氨基酸殘基，與POPG膜有作用的主要是多肽鏈頭尾部分的氨基酸殘基加上中間部分的帶電殘基，這說明靜電相互作用對于多肽和細菌質膜的作用有重要意義。

為研究S4(13)穿過質膜在膜中的擴散過程，利用增強采樣的方法對這一過程進行模擬。因此，采用傘形采樣的方法模擬S4(13)分子從質膜中心擴散到水相中的過程，從而對比S4(13)在2種質膜上吸附和擴散的難易程度。

對傘形采樣的數據應用加權直方圖分析方法計算平均力勢(圖2)，PMF曲線表示S4(13)的自由能沿著質膜中心到水相距離變化(定義質膜中心的位置為0)。圖中結果表明單分子S4(13)吸附到POPG膜表面上比吸附到POPC膜表面上更容易,其自由能呈現下降趨勢，表明S4(13)吸附到POPG膜表面是自發的過程。在POPC膜體系中，多肽吸附到膜上首先自由能需升高5.19 kJ/mol。而對于多肽從膜中心向水相擴散的過程：在POPC體系中，多肽質心在z軸方向0.425 nm位置處和膜的結合最穩定，在POPG體系中，在z軸方向0.192 nm位置處和膜的結合最穩定。在POPC膜體系中從質膜中心擴散到水相的勢壘為181.45 kJ/mol；而對于POPG膜體系，多肽從質膜中心擴散到水相的勢壘為136.28 kJ/mol，該結果表明多肽S4(13)不容易以單分子的形式穿過細胞膜。

圖2 POPC和POPG 膜體系中S4(13)從質膜中心沿z軸方向向水層擴散的平均力勢曲線Fig.2 PMF profiles for the peptide S4(13) to move from membrane center to aqueous solution along z direction in POPC and POPG systems

2.3 多個S4(13)分子與不同質膜相互作用對比

回轉半徑可以表征體系聚集的程度，如圖3所示，黑線是回轉半徑隨時間的變化，用紅線擬合變化趨勢。在S4、S6和S7體系中，根據回轉半徑曲線的趨勢可以看出聚集現象的發生。而對于S5體系，不容易發生聚集現象。這表明在POPC膜和水溶液中，S4(13)容易發生聚集，在POPG膜上由于和質膜形成強的相互作用，S4(13)的運動受到限制不容易發生聚集。

圖4中4個體系的初始結構和模擬后的穩定結構對比單個S4(13)與多個S4(13)分子與不同質膜的作用，每個體系的S4(13)都用紅色的cartoon模型表示，磷原子顯示為橙色小球模型，水分子和磷脂分子都顯示為線狀模型。為便于觀察，隱藏抗衡離子。S2和S3體系采用側視圖，S4和S5體系采用俯視圖，多肽的起始位置都被放置在距離膜表面相同距離的位置處。由圖結果可知，平衡后的4個體系中的構象都發生了很大的改變：S2和S3體系的結果和2.2小節的分析一致，多肽S4(13)分子的兩端都被錨定在POPG膜上，而在POPC膜上只有一端被固定。S4體系的5個S4(13)分子在POPC膜上發生了聚集，傾向于形成四聚體結構(圖S4(b))；S5體系的5個S4(13)分子和膜有較強的靜電相互作用，這限制了分子的運動，導致S4(13)分子在POPG膜上不能發生聚集。S7水相體系的起始和平衡后的結構和S8體系穩定后的S4(13)結構也證明多個S4(13)分子在水相中容易發生聚集形成四聚體(圖S4(a)、S4(c))。此外，游離在聚集體之外的單個S4(13)，因為沒有形成聚集體結構失去了螺旋結構。S6體系由于水相中S4(13)分子運動較靈活且間隔較遠，沒有形成四聚體，但是有形成四聚體結構的趨勢。通過觀察S7和S8體系的結果，也證明S4(13)在水相中有形成四聚體的傾向。

圖3 各個體系S4(13)骨架原子的回轉半徑隨模擬時間變化曲線Fig.3 The radius of gyration changes for backbone atoms of S4(13) in each system with simulation time

圖4 S2～S5體系模擬前的初始結構和模擬后的穩定結構Fig.4 The initial structures before simulations and the equilibrated structures after simulations for systems S2-S5

對S4、S5、S7和S8體系中S4(13)進行殘基間接觸強度和軌跡相關系數的分析(圖5)，S4和S5接觸強度的結果和圖4一致，結合S7和S8體系的結果，說明S4(13)在POPG膜上不聚集，在POPC膜和水溶液環境下才會傾向于形成四聚體。S4、S7和S8體系相關系數的結果(圖5(e)、5(g)、5(h))與接觸強度的結果(圖5(a)、5(c)、5(d))一致，圖中4個S4(13)分子的相關性很強，S5體系由于S4(13)和質膜表面有較強的結合作用，因此表現出運動的一致性，所以會存在4個分子運動相關性很強的情況(圖5(f))，這從另一方面說明了多個S4(13)分子和POPG膜的穩定結合作用。

圖5 S4、S5、S7和S8體系S4(13)殘基間的接觸熱圖(a～d)和相關系數熱圖(e～h)Fig.5 The contact intensity maps (a-d) and correlation maps (e-h) for residues of S4(13) for systems S4, S5, S7, and S8

2.4 單分子和多分子S4(13)與不同質膜作用時的構象變化

文獻表明，S4(13)可以形成螺旋結構，S4(13)在穿膜過程中伴隨著構象的變化，這種結構變化與S4(13)穿膜機理可能有聯系。常規分子動力學模擬的結果表明單個S4(13)分子和質膜相互作用時，螺旋結構被破壞，氫鍵分析結果也表明分子內氫鍵占有率極低。對各體系進行二級結構隨模擬時間變化的分析(圖S6)，表2中顯示的是S1～S8體系每個S4(13)分子二級結構的時間占比，S4～S8體系中S4(13)分子的二級結構隨時間的變化顯示，聚集體的α-螺旋比例較高，提示形成S4(13)分子聚集體有利于維持α-螺旋結構。對單個S4(13)分子在POPC和POPG膜上的傘形采樣的軌跡進行二級結構分析，結果表明單個S4(13)分子嵌入到膜內區域時傾向于維持螺旋結構，在水相傾向于形成無規卷曲的結構，因此膜相疏水環境比水相環境更有利于單個多肽分子維持螺旋結構，這對聚集體與質膜的作用也具有很好的參考意義。

2.5 單個S4(13)分子與不同質膜結合時的氫鍵相互作用

氫鍵是維持超分子結構穩定的重要相互作用。在S4(13)與質膜結合初期，分子內氫鍵是維持螺旋結構的關鍵，分子間氫鍵則對多肽與質膜的結合發揮重要作用。統計S2和S3體系中S4(13)與質膜作用的氫鍵，取出占有率靠前的氫鍵(表3、表4)，對于POPC的體系，主要是S4(13)分子的Ala-1和Trp-3殘基與質膜形成氫鍵，因此只是肽鏈的一端與質膜有較強的相互作用。對于POPG體系，Lys-9、Lys-12、Lys-4和Ala-1殘基參與形成氫鍵。從形成氫鍵的數量上對比，也進一步證明了POPG和S4(13)分子的結合更強。綜上，S2和S3體系的氫鍵分析表明：靜電相互作用對于多肽與細菌質膜的結合發揮了重要作用，帶負電的POPG質膜更容易和帶正電的多肽S4(13)形成氫鍵；不帶電的POPC質膜更傾向于和S4(13)的疏水殘基作用。這和前面單個S4(13)分子與不同質膜作用的結果一致，也和S2和S3體系的結構圖一致。

表2 各個體系模擬過程中S4(13)各種二級結構的占比 (體系有多個多肽的標記為Pep1～5)Table 2 The proportion of second structure for S4(13) in each system during the simulation time(The systems with multiple peptides are listed as Pep1-5) %

表3 S2體系中S4(13)和POPC膜形成的氫鍵Table 3 The hydrogen bonds formed between S4(13) and POPC membrane for S2 system

對比單個S4(13)分子結合到質膜表面的構象變化，分析傘形采樣體系S4(13)與質膜的分子間氫鍵相互作用(表S1、S2)和S4(13)分子內氫鍵相互作用(圖S5)。POPC體系形成的分子間氫鍵比POPG體系形成的分子間氫鍵更穩定一些，這與S4(13)結合在質膜表面的情況不同，S4(13)在質膜內形成了更多與POPC質膜的氫鍵作用，可能是膜內的疏水環境導致。同樣，POPC和POPG膜體系的分子內氫鍵的數量圖(圖S5)顯示在質膜內的數量要大于水相環境中的數量，因此在膜內更容易維持螺旋結構，在水相螺旋結構被破壞。在POPC膜內S4(13)的分子內氫鍵的數量更多。這些說明S4(13)在POPC膜內更穩定，這個結論和PMF曲線(圖2)給出的結論一致。

表4 S3體系中S4(13)和POPG膜形成的氫鍵Table 4 The hydrogen bonds formed between S4(13) and POPG membrane for S3 system

對于維系多個S4(13)體系聚集體存在相互作用的情況，S8體系聚集體之間的接觸強度(表S3)和分子間氫鍵分析(表S4)表明，聚集體之間的結合依賴于疏水殘基間的疏水相互作用。接觸強度可以看作一定距離內所有作用力的集合，提取0.5 nm以內的接觸強度大于50的相互作用殘基，表中顯示疏水性殘基對S4(13)分子聚集起著關鍵作用。S4和S7體系內S4(13)分子間的接觸強度(表S5、表S6)進一步證明了疏水殘基對于形成聚集體的重要性。

2.6 多個S4(13)分子在水相的聚集

為證明S4(13)分子能自發在水溶液中形成聚集體，進行了傘形采樣動力學模擬，得到平均力勢的結果如圖6(結構圖表示反應坐標為1.0和2.0 nm處的S4(13)結構，分別對應于單個S4(13)分子和其他3個S4(13)分子結合最穩定的狀態和完全遠離聚集體結構的狀態，其中疏水性氨基酸殘基顯示為紅色，親水性氨基酸殘基顯示為天藍色)。從圖中可知單個多肽從聚集體中解離需跨越的勢壘約為14.60 kJ/mol，這表明單個多肽在水相中形成聚集體是有利的，即S4(13)的聚集現象是普遍存在的。

圖6 水溶液體系傘形采樣模擬的平均力勢(PMF)曲線Fig.6 The PMF plots of umbrella sampling simulation for water system

3 結論

本文利用分子動力學模擬的手段，分析單個S4(13)和多個S4(13)在真核生物質膜(POPC)和細菌質膜(POPG)中發生的相互作用，模擬結果表明：POPG膜對S4(13)分子具有較強的吸引作用，可以約束S4(13)兩端的Ala-1和Ala-13殘基，并且與S4(13)多肽鏈中間部分的帶電殘基Lys-4、Lys-9和Lys-12有重要的相互作用，將多肽錨定在質膜表面；而POPC膜對S4(13)的吸引作用較弱，只能吸引S4(13)分子一端的Ala-1、Leu-2和Trp-3殘基。S4(13)和質膜的氫鍵分析表明靜電相互作用有利于多肽在質膜界面的穩定，而疏水相互作用有利于多肽在質膜內部的穩定。S4(13)在POPC和POPG質膜上的傘形采樣模擬表明單個S4(13)分子都可以和質膜發生作用，被吸附到POPG膜上更容易，但都不容易穿過質膜。多個S4(13)分子與不同質膜的模擬結果表明S4(13)分子在水溶液和POPC膜上容易以四聚體的形式聚集，所以S4(13)分子更傾向于以聚集體的形式穿過生物膜。傘形采樣模擬的結果也表明在水相中容易發生S4(13)分子的聚集。分析殘基間的相互作用表明S4(13)聚集主要依賴于疏水性氨基酸殘基。另外，單個S4(13)分子在與質膜作用的初始階段螺旋結構會被破壞，但在膜內能維持螺旋結構的穩定。當S4(13)分子以聚集體形式存在時，螺旋結構能較穩定地存在。綜上，該研究結果為探究細胞穿膜肽和質膜的作用提供了理論依據，這對于拓展細胞穿膜肽在臨床上的應用有重要意義。