腫瘤相關巨噬細胞與肝癌轉移的研究進展

呂會艷，李成城

(1. 濟南市槐蔭人民醫院 內科，山東 濟南250000；2. 蘭州大學 第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見且最具有侵襲性的炎癥相關性惡性腫瘤之一，遠處轉移是HCC患者死亡的主要因素。轉移不僅與腫瘤細胞自身生物學特性相關，還受瘤組織內微環境成分之間相互作用的驅動。在HCC中，腫瘤的基質成分主要由成纖維細胞、內皮細胞和腫瘤浸潤炎細胞組成。這些細胞產生的腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)調節腫瘤細胞的活動，參與了腫瘤的發展和對各種治療的應答。

腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages, TAMs)是TME的主要成分，在炎癥相關癌癥的進展中發揮著關鍵作用[1-2]。在體內，TAMs通過產生大量細胞因子、趨化因子、生長因子和基質金屬蛋白酶等物質抑制適應性免疫、加速瘤細胞生長、促進瘤內血管生成和遠處轉移[3]，成為近年研究的熱點。臨床研究也發現，瘤組織樣本中浸潤的巨噬細胞數量及表型與患者的預后密切相關，尤其是在甲胎蛋白陰性的患者中[4]，但目前的研究結果尚存矛盾。因此，系統地了解TAMs與HCC的關系非常重要，本文就TAMs在HCC轉移中的作用進行綜述。

1 TAMs的來源、功能與調控

巨噬細胞主要來自于骨髓源性循環單核細胞[5]，具有極強的可塑性。除此之外，肝臟中的巨噬細胞還包括肝內固有巨噬細胞-庫普弗細胞，但其可塑性較低，一般表現為免疫抑制表型。募集到組織的單核細胞受到細菌或病毒等微生物刺激時，將分化為分泌白介素6(interlukin-6, IL-6)、IL-12和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)，具有吞噬、促炎、調節穩態、激活免疫應答并破壞腫瘤細胞的M1型巨噬細胞(經典活化巨噬細胞)，發揮抑瘤活性；與M1型巨噬細胞相反，單核細胞接受免疫復合物等物質的刺激也會分化為分泌IL-4/10/13、轉化生長因子β(transforming growth factor β, TGF-β)、程序性死亡受體-配體1(programmed cell death-ligand 1, PD-L1)、趨化因子家族和精氨酸酶1(arginase 1, Arg 1)，具有促進組織修復和腫瘤生長的M2型巨噬細胞(替代活化巨噬細胞)，發揮促瘤活性[6-7]。M1和M2型巨噬細胞之間的轉換是一種響應微環境信號的生物學現象，稱為“巨噬細胞極化”。相關證據顯示，在大多數腫瘤中，TAMs的特征與M2型巨噬細胞相似[8]。而TME促使巨噬細胞分化傾斜，向促瘤方向發展[9-10]，如集落刺激因子1 (colony stimulating factor 1, CSF-1) 和 C-C基序配體2 (C-C motif ligand 2, CCL2)是兩種最有效的募集巨噬細胞和M2型巨噬細胞極化的刺激因子，在腫瘤組織中高表達，通過激活骨髓細胞上磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)或Toll樣受體(Toll like receptors, TLRs)，促進腫瘤轉移。

2 TAMs促進腫瘤轉移的機制

腫瘤轉移是腫瘤細胞從原發部位逃逸，通過淋巴管道、血液循環或體腔播散到其他部位繼續生長的多步驟過程[2]，主要包括：(1)原發部位脫落；(2)脈管內入侵及外滲；(3)轉移部位的適應性生長。多項研究表明，TAMs參與了上述過程的每一階段。

轉移始于腫瘤細胞喪失固有極性，獲得侵襲能力，上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是這一事件的主要表現形式。TAMs分泌多種生長因子、促炎因子和酶，包括TGF-β、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)、TNF-α、IL-6、IL-1β、基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase，MMPs：MMP-2、MMP-7、MMP-9 和 MMP-12)、蛋白水解酶以及血管生成調節酶環氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)等，是腫瘤微環境的重要組成部分。IL-6、IL-1β和TNF-α可激活信號轉導分子Smad、Wnt、PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B, PKB )、核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)及信號傳導轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)信號通路，繼而活化轉錄因子Snail家族和Twist，促使腫瘤細胞由上皮細胞型向間質細胞型轉變，導致細胞間粘附力下降，瘤細胞脫落進入間質，獲得易于向遠處轉移的能力[6]。體外實驗顯示，用培養M2型巨噬細胞的培養基培養HCC細胞，結果HCC細胞內TLR4/STAT3信號通路被激活，EMT標記物的表達水平升高，瘤細胞轉移能力也增強[11]。在臨床工作中也發現，結直腸癌患者腫瘤組織中TAMs的數量與癌細胞的Snail表達呈正相關[12]。

瘤體的快速生長需要比正常組織更多的血管提供氧氣和營養物質，而瘤組織中的新生血管也成為了惡性腫瘤轉移的主要途徑。隨著腫瘤體積的增大，TME也逐漸變為缺氧的狀態。TAMs在瘤細胞缺氧或缺乏營養物質的刺激下分泌大量VEGF、TNFα、PDGF和TGF-β，引起血管內皮細胞的增生，促進新生血管形成。另外，TAMs分泌的蛋白水解酶和MMPs還可趨化上述促血管形成細胞因子到腫瘤組織，加速血管形成過程[2]。近期研究還發現，TAMs中存在一種新型的亞群，這些細胞表達酪氨酸蛋白激酶受體Tie-2，也稱為血管生成素-1受體，與所有已知的血管生成素(angiogenin, Ang)(包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4)均能結合，具有顯著的促血管生成活性[13]。而這些新生血管內皮細胞結構松散、基底膜不完整或缺失、管壁通透性高，為脫落瘤細胞向血管外游走提供了條件；此外，TAMs也通過調節淋巴管內皮細胞增殖、分化，促進淋巴管形成，從而增加腫瘤淋巴管轉移的風險[14]。

腫瘤細胞固有極性喪失后的順利轉移除了沖破脈管系統外，還需要松散的周圍組織結構。細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是腫瘤細胞遷移的主要屏障。腫瘤微環境中增加的蛋白水解酶、MMPs可直接作用于細胞間連接，使瘤細胞連接松散、基底膜破壞、ECM降解，既增加了瘤細胞的脫落能力，也為脫落瘤細胞的游走提供空間，促進瘤細胞的局部侵襲和遠處轉移[15]。

3 TAMs在肝細胞癌發展中的作用

上述研究表明，TAMs是TME的重要組成部分，而TAMs浸潤可以在不同方面促進腫瘤的生長和轉移，影響患者預后?；谶@些發現，以TAMs為靶點，以抑制TAMs趨化、減少瘤細胞EMT、降低腫瘤區域血管形成、抑制ECM降解為方向治療肝癌不失為一種策略。

CSF-1是一種重要的巨噬細胞生長因子，在單核細胞趨化和M2型巨噬細胞極化過程中均發揮關鍵作用。與非轉移性肝癌相比，轉移性肝癌肝臟中 CSF-1 基因的表達水平較高[6]。Cai等[16]的研究結果顯示，肝癌細胞分泌的CSF-1通過CSF1R-ERK1/2-C-Jun信號通路增加巨噬細胞同種異體移植炎癥因子1(allograft inflammatory factor 1, AIF1)的表達。將AIF1與小鼠肝癌細胞(Hepal-6)和RAW264.7細胞共培養，RAW264.7細胞表達的趨化因子CXCL16將會增加，癌細胞的遷移能力增強。同樣，在人類肝癌組織中，AIF1陽性的巨噬細胞與微血管浸潤和TNM分期有關，并與患者的總體生存率和無病生存率相關(P=0.002)。而CSF-1R抑制劑——PLX3397可減少巨噬細胞浸潤并增強放療和免疫治療的療效[15]。但不同的腫瘤對CSF-1R抑制表現出不同的反應，應根據腫瘤的類型和位置給予TME靶向治療，以阻斷腫瘤進展和轉移。

CCL2是另一種有效募集巨噬細胞和極化M2型巨噬細胞的刺激因子。Li等[17]采用免疫組化方法檢測腫瘤組織切片發現，在兩組獨立的HCC患者隊列中，腫瘤組織CCL2蛋白表達量相對于癌旁和非腫瘤組織均升高。與癌旁組織相比，隊列Ⅰ和隊列Ⅱ中分別有86.4%和74.0%的腫瘤組織顯示CCL2表達增加。而且，在這兩個隊列中，CCL2表達量和總生存期之間呈負相關。多變量Cox風險分析也顯示，腫瘤來源的CCL2是HCC總生存期的獨立預測因子。若應用CCR2拮抗劑阻斷CCL2/CCR2信號通路，則顯示HCC小鼠移植瘤模型的肝臟腫瘤中巨噬細胞浸潤減少，M2型細胞因子減少(IL-6、CCL2、G-CSF)，CD8+T和CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞增加，瘤組織生長受到抑制，腫瘤切除術后復發率也明顯降低。目前，臨床工作中用來治療肝癌的藥物也被發現不同程度地影響巨噬細胞的數量與表型。酪氨酸激酶抑制劑索拉非尼是治療晚期肝癌的一線藥物[18]。近年研究表明，索拉非尼在抑制原位腫瘤生長的同時也會動員大量巨噬細胞進入血液，并促進巨噬細胞向M2型極化，影響肝癌的預后[19]。TG100-115作為一種新型的PI3K-γ 抑制劑，可逆轉TAMs的表型、抑制腫瘤血管生成、增強細胞毒性T淋巴細胞的募集，改善肝癌的預后[20]。動物實驗也證實，TG100-115可調節索拉非尼募集的巨噬細胞向M1 型轉化，與索拉菲尼聯用的抑瘤率(63.48%)明顯高于索拉菲尼(46.09%)和TG100-115(40.87%)單藥治療[21]。Ndrg2是一種PTEN結合蛋白，阻止PTEN磷酸化，從而通過降低癌細胞的增殖和代謝以及抑制血管生成而發揮抗腫瘤功能[22]。Li等[23]通過建立野生型和Ndrg2基因缺失(Ndrg2-/-)型小鼠的肝癌模型發現，Ndrg2-/-小鼠肝癌移植瘤TAE中有較高比例的M1型巨噬細胞浸潤，瘤體生長也受到顯著抑制。針對這一結果該團隊進一步研究表明，Ndrg2不僅參與巨噬細胞的成熟，也通過抑制NF-κB信號通路的激活調節巨噬細胞向M2型極化使TAE向促腫瘤的狀態轉化。

以上結果說明，在部分基礎和臨床研究中，通過不同方式抑制TAMs的募集和M2型巨噬細胞的極化或促進M2型巨噬細胞向M1型轉化可減慢肝癌組織生長及瘤體轉移，提高移植瘤小鼠和肝癌患者的生存率。

缺氧是調控肝癌微環境的關鍵因素[24]。Jiang等[25]報道，缺氧除了直接誘導TAMs向缺氧區域遷移外，還通過刺激腫瘤細胞合成分泌高遷移率族蛋白B1而加劇巨噬細胞向M2型極化，從而釋放IL-6促進肝癌細胞發生EMT，促進腫瘤的侵襲和轉移。不僅如此，缺氧還可上調Ang 2[26]，此時缺氧區具有更強的促血管生成及轉移能力。Zhang等[24]研究也證明，在中度缺氧條件下TAMs會分泌更多的IL-1β。在持續嚴重缺氧條件下，肝癌細胞的壞死碎片激活TLR4/TRIF(TIR結構域受體)/NF-κB信號通路，進一步誘導TAMs釋放IL-1β。隨著腫瘤微環境中 IL-1β 的增加，由IL-1β通過COX-2誘導的HIF-1α 的合成隨之增加；另一方面，缺氧抑制HIF-1α降解，過量表達的HIF-1α隨即增加了肝癌細胞EMT的速度。該團隊在肝癌動物模型中也發現，IL-1β促進肝癌轉移，預后不良。因此，在缺氧的腫瘤組織中，TAMs在EMT過程中發揮了重要作用，從而促進腫瘤轉移。Fu等[27]從另一個角度也發現了TAMs與EMT 的關系。首先該團隊從HCC腫瘤組織切片中觀察到，腫瘤組織EMT明顯的位置高表達CD68；隨后團隊學者將肝癌細胞與巨噬細胞共培養24 h，結果發現肝癌細胞遷移侵襲能力明顯增強，Snail和N-Cadherin表達上調，E-Cadherin下調。

以上多項研究證據表明TAMs可通過不同機制促進肝癌細胞發生EMT，促進肝癌轉移，部分阻斷這些促EMT通路也許會抑制肝癌的生長及轉移。

4 結 語

綜上所述，TAMs是TME中最關鍵的細胞之一，通過多種機制促進HCC的生長和轉移，預期針對消除TAMs,阻止巨噬細胞浸潤和抑制M1的M2表型轉化進行干預是可行的。但無論是針對哪一步驟的TAMs靶向治療，都是在間接攻擊腫瘤細胞。聯合TAMs靶向藥物與放化療、抗血管生成藥物和免疫檢查點抑制劑的方法可能對抑制腫瘤進展與轉移起協同作用。但需要重視的是，巨噬細胞本屬于炎性細胞，在炎癥反應中，其表型的轉變前期有助于破壞及吞噬病原體，后期協助炎癥消退及促進傷口愈合。愈合過程中的血管生成、ECM沉積和組織重塑恰好可以被腫瘤細胞利用，促進瘤細胞生長及轉移。一味地降低TAMs的數量是否會給患者帶來副作用，抑制TAMs帶來的益處是否絕對多于弊端還需大型隨機臨床對照試驗來佐證。因此，鑒于巨噬細胞功能的復雜性，若能局部應用靶向TAMs的相關藥物聯合目前現有治療手段或許是肝癌治療的新方向。