基于網絡藥理學探討緩衰方對慢性腎臟病心腎保護作用的機制

劉童童 王宇陽 王倩 冒慧敏 占永立

摘要 目的：探討緩衰方對慢性腎臟?。–KD）心腎保護作用的機制。方法：基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索緩衰方中5味中藥的有效活性成分并獲得相應的預測靶點;通過GEO數據庫、GeneCards數據庫和人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM）檢索與CKD和心血管疾?。–VD）相關的靶點，并對藥物靶點和疾病靶點進行映射取交集作為緩衰方對CKD患者心腎保護作用的關鍵靶點?；赟tring數據庫對關鍵靶點進行蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡分析，并通過拓撲分析得到緩衰方對CKD患者心腎保護作用的核心靶點，基于autodock軟件對緩衰方的活性成分和核心靶點作分子對接，分析成分和靶點的結合能力。并對關鍵靶點進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結果：共得到緩衰方有效活性成分105種，預測靶點135個，得到CKD疾病相關靶點1 436個，CVD疾病相關靶點744個。共得到緩衰方對CKD心腎保護作用的關鍵靶點53個，拓撲分析得到核心靶點18個，分子對接結果顯示緩衰方的11個活性成分和10個核心靶點平均最低結合能為-6.58 kcal/mol，其中豆甾醇、槲皮素與PTGS2靶點蛋白結合能最高。共得到對氧含量的反應、細胞對藥物的反應、循環系統中的血管過程等1 275個GO富集結果和低氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、白細胞介素-17（IL-17）信號通路等76條KEGG信號通路。結論：緩衰方通過多成分、多靶點、多信號通路途徑實現對CKD的心腎保護作用。

關鍵詞 網絡藥理學;緩衰方;慢性腎臟病;心血管疾病;活性成分;靶點;信號通路;作用機制

Abstract Objective：To explore the mechanism of the heart and kidney protective effect of Huan Shuai Formula on the chronic kidney disease（CKD）.Methods：We searched for targets related to CKD and Cardiovascular Disease（CVD） through GEO database，GeneCards database and Human Mendelian Inheritance Database（OMIM），and map drug targets and disease targets to take the intersection as a slowing down prescription as the key target of cardio-renal protection in CKD patients.The protein-protein interaction（PPI） network analysis of key targets was based on the String database，and topological analysis was used to obtain the core targets of the heart and kidney protection of CKD patients.Based on the autodock software，molecular docking of the active ingredients and core targets of the Huan Shuai formula was performed，and the binding ability of the ingredients and the targets was analyzed.And we carried out GO（Gene Ontology） biological process enrichment analysis and Genome Encyclopedia（KEGG） pathway enrichment analysis for key targets.Results：A total of 105 active components，135 predicted targets，1 436 CKD disease related targets and 744 CVD disease related targets were obtained.A total of 53 key targets for the cardio-renal protection of CKD by Yan shuai Formula were obtained，and 18 core targets were obtained by topological analysis.The molecular docking results showed that the average minimum binding energy of 11 active ingredients and 10 core targets of Yan Shuai Formula was-6.58 kcal/mol，of which stigmasterol and quercetin had the highest binding energy to PTGS2 target protein.A total of 1275 GO enrichment results，hypoxia inducible Factor-1（HIF-1） signaling pathway，Tumor Necrosis Factor（TNF） signaling pathway，Interleukin-17（Interleukin-17，IL-17），the 76 KEGG signal pathways were obtained.Conclusion：Huan Shuai Formula can protect the heart and kidney function of CKD through multi-component，multi-target and multi signal pathway.

Keywords Network pharmacology; Huan Shuai Formula; Chronic kidney disease; Cardiovascular disease; Active components; Targets; Signaling pathway; Mechanism

中圖分類號：R242;R692文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.004

慢性腎臟?。–hronic Kidney Disease，CKD）已成為全球共同關注的公共衛生問題，全世界超過13.4%的成年人患有CKD[1]。在我國，成年人CKD的發病率約為10.8%[2]。心血管疾?。–ardiovascular Disease，CVD）為CKD常見的并發癥，超過64.5%的CKD患者患有不同程度的CVD，約為健康人群的2～4倍[3-4]。有研究表明，隨著CKD的進展，CVD的發生風險顯著增加，終末期腎臟疾?。‥nd Stage Renal Disease，ESRD）患者CVD的發生率可達80%[5]。CKD患者血脂異常、血壓控制不佳等傳統CVD危險因素導致動脈硬化和心肌重構是CVD形成的基本病變，臨床主要表現為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心律失常、慢性心力衰竭等[6-8]。CKD腎素-血管緊張素-醛固酮系統（Renin-angiotensin-aldosterone System，RAAS）激活、蛋白尿、腎小球濾過率下降、貧血、全身營養不良等非傳統CKD危險因素，可加速CVD進展;而心輸出量的減少和靜脈壓的增加，使腎臟灌注減少，導致腎功能丟失加速。CKD和CVD的相互影響使伴有CVD的CKD患者死亡率高達50%，為健康人群的10～30倍，是CKD死亡的首要因素[9]。由此可見，CKD患者防治CVD至關重要。

緩衰方以黃芪、丹參、當歸、大黃、白花蛇舌草為核心組成，具有益氣活血、解毒降濁之效。臨床和實驗研究發現，緩衰方能夠有效改善CKD患者的生命質量，延緩CKD患者進入終點事件（透析、全因死亡、血清肌酐雙倍增加）的時間[10-11]。在長期臨床實踐中我們發現，緩衰方可顯著減輕CKD患者胸悶、胸痛、心悸等CVD癥狀。然而目前關于緩衰方對CKD心腎保護作用的有效活性成分、作用靶點和作用機制尚未完全闡明。因此，本研究擬采用網絡藥理學的方法從分子水平方面研究和分析緩衰方對CKD患者心腎保護作用的有效活性成分、潛在靶點和作用機制，以期為緩衰方的應用和開發提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 緩衰方活性成分及靶點的篩選 通過檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），收集緩衰方中“黃芪”“丹參”“當歸”“大黃”“白花蛇舌草”5味中藥的活性成分，根據活性成分的藥物毒代動力學參數進行篩選，以類藥性（Drug-like，DL）≥0.18和口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%的化合物作為緩衰方的有效活性成分。同時根據TCMSP數據庫整理有效活性成分所涉及的靶點，并通過Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org）進行靶點信息比對和靶點名校正。

1.2 CKD和CVD疾病相關靶點的檢索 GEO數據庫是全球最大的公共基因表達數據庫，具有較全面的高通量分子數據。以關鍵詞“chronic kidney disease”在GEO數據庫中檢索與CKD相關的靶點，選擇物種為人類（Homo Sapiens），對得到的基因靶點進行整理并找出差異基因靶點。同時分別在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org）和人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，https：//www.omim.org）檢索與CKD和CVD相關的疾病靶點，保留相關評分（Relevance Score）≥25的疾病相關靶點。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建 利用半編程性質的腳本性軟件R project（×64 3.6.1）對緩衰方活性成分所預測的靶點和CKD、CVD相關的疾病靶點進行映射，獲得3個靶點數據的交集作為緩衰方對CKD心腎保護作用的關鍵靶點進行機制探討。使用Bisogenet數據庫（http：//stringdb.org）構建關鍵靶點的蛋白質-蛋白質相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）網絡，設定物種為人類（Homo Sapiens），基于Cytoscape（Version 3.7.2）軟件的cytNCA插件計算PPI網路中各節點的度中心性（Degree Centrality，DC）、中介中心性（Betweenness Centrality，BC）和緊密中心性（Closeness Centrality，CC）等信息并進行拓撲分析，選取DC、BC和CC值均高于均值的靶點作為核心靶點?；赑ubchem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）查找緩衰方藥物活性成分的3D結構，并進行能量最小化處理，利用RCSB PDB數據庫（http：//www.rcsb.org）查找核心靶點的相關蛋白晶體結構，利用PyMOL（Version 1.7.2）軟件對靶點蛋白進行去水、加氫處理，并以對心腎血管具有保護作用的厄貝沙坦（Irbesartan）作為陽性對照，基于autodock（Version 1.5.6）軟件對緩衰方藥物活性成分和靶點相關蛋白進行分子模擬對接，并計算最低結合能（Binding Affinity），最低結合能≤-5 kcal/mol則說明藥物活性成分和靶點蛋白對接較好，結合能的絕對值越大說明活性成分與靶點蛋白結合越好[12]。

1.4 網絡分析 基于bioconductor數據庫（http：//www.bioconductor.org）對緩衰方心腎同治作用的關鍵靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）生物學過程富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，保留P<0.05，Q<0.05的富集結果，獲得關鍵靶點參與的生物過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）和作用信號通路?；贑ytoscape軟件，構建“成分-靶點-通路”網絡，對緩衰方活性成分、靶點和疾病之間的相互關系進行分析。

2 結果

2.1 緩衰方的活性成分及靶點 共得到緩衰方的活性成分105種，包括大黃的活性成分16種、丹參的活性成分65種、白花蛇舌草的活性成分7種、黃芪的活性成分20種、當歸的活性成分2種。其中當歸、白花蛇舌草共屬活性成分1種，丹參、白花蛇舌草共屬活性成分1種，黃芪、白花蛇舌草共屬活性成分1種，大黃、當歸、白花蛇舌草共屬活性成分1種。見圖1。共得到預測靶點1 988個，其中白花蛇舌草預測靶點200個、大黃預測靶點146個、丹參預測靶點1 177個、當歸預測靶點77個、黃芪預測靶點388個。經過剔重后得到靶點135個，預測靶點超過35個的活性成分共有18種。見表1。

2.2 CKD和CVD的疾病相關靶點 共得到CKD疾病相關靶點1504個，其中來自GEO數據庫485個（上調靶點240個，下調靶點245個）、GeneCards數據庫591個、OMIM數據庫428個;CVD疾病相關靶點795個，其中來自GeneCards數據庫322個、OMIM數據庫473個。經過剔重后共等到CKD疾病相關靶點1 436個，CVD疾病相關靶點744個。見圖2。

2.3 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建 共得到緩衰方對CKD心腎保護作用的關鍵靶點53個。見圖3?；贑ytoscape軟件對得到的關鍵靶點進行PPI網絡分析，共得到53個蛋白節點，361條邊，平均度值為13.6。對PPI網絡進行拓撲分析，共得到DC、BC、CC均大于均值的核心靶點18個。見表2?；贏utodock軟件對預測靶點超過40個的緩衰方活性成分和前10個核心靶點進行分子模擬對接，結果顯示緩衰方各活性成分和靶點蛋白對接的平均最低結合能為-6.58 kcal/mol，與陽性藥物和核心靶點對接的最低結合能比較無明顯差異;除豆甾醇、β-谷甾醇與IL1β靶點蛋白對接的結合能外，其余最低結合能均≤-5 kcal/mol。見圖4。其中豆甾醇、槲皮素與PTGS2的結合能絕對值最高，其分子對接模式見圖5。

2.4 富集分析 共得到緩衰方對CKD心腎保護作用的GO富集結果1 275個，其中BP1 172個、CC 43個、MF 60個。生物過程主要包括對氧含量的反應（Response to Oxygen Levels）、細胞對藥物的反應（Cellular Response to Drug）、循環系統中的血管過程（Vascular Process in Circulatory System）、血壓的調節（Regulation of Blood Pressure）、對營養水平的反應（Response to Nutrient Levels）等;細胞組分主要有膜微區（Membrane Microdomain）、膜區（Membrane Region）等;分子功能主要包括絲氨酸型內肽酶活性（Serine-type Endopeptidase Activity）、類固醇激素受體（Steroid Hormone Receptor Activity）等。見圖6。GO富集分析的生物過程中關鍵靶點的參與情況見圖7。共得到KEGG信號通路76條，其中與心腎疾病相關的信號通路包括：低氧誘導因子-1（Hypoxia Inducible Factor-1，HIF-1）信號通路、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）信號通路、白細胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白質絲氨酸-蘇氨酸激酶（Protein-serine-threonine Kinase，AKT）信號通路、內分泌抵抗、血小板活化、細胞骨架等。見表3。各信號通路之間的相互關系網絡見圖8，信號通路與關鍵靶點的相互關系網絡見圖9。對緩衰方有效活性成分、關鍵靶點參與CKD心腎保護作用的信號通絡構建“成分-靶點-通路”網絡圖。見圖10。

3 討論

CKD屬于中醫學“虛勞”“水腫”“尿濁”等病的范疇，其病機多以本虛標實、虛實夾雜為特點：本虛以肺脾腎虧虛為主，標實則多為水濕痰瘀阻滯。邪伏不去，影響氣機升降出入，久蘊乃成濁毒。脈為血之府，濁毒隨氣血游行，侵損脈絡。心主血脈，濁毒積蓄，導致心失司用，使機體并發“胸痹”“關格”“溺毒”?！蹲C治準繩》提出關格的治則當遵循“治主當緩，治客當急”。因此，CKD并發CVD的治則當以補腎活血、化濁解毒為要。臨床實踐發現，CKD的進展與中醫“濁毒”的致病特點密切相關，使用芳香、滲濕、通腑、辛開苦降等化濁解毒的治法對延緩CKD的進展有較好的治療作用[13]。緩衰方由黃芪、丹參、當歸、大黃、白花蛇舌草5味藥物組成，方中黃芪為補氣要品，《藥性賦》言黃芪可“溫分肉而實腠理，益元氣而補三焦”，當歸、丹參補血活血，黃芪合當歸、丹參補氣活血而不留瘀，白花蛇舌草為清熱解毒之品，配以大黃蕩滌出新，全方合伍共奏益氣活血、去濁解毒之功。研究發現，CKD患者尿毒癥毒素在體內蓄積是并發CVD的重要原因[14]。藥理學研究發現，活血解毒的中藥可有效減少尿毒癥毒素的蓄積從而延緩CKD、CVD進展[15-16]。

本研究共檢索出緩衰方中有效活性成分105種，得到預測靶點135個，其中緩衰方對CKD心腎保護作用的關鍵靶點53個，拓撲分析得到核心靶點18個，包括IL6、EGF、VEGFA、IL1β、CCL2等，這些靶點均與CKD、CVD的發生和進展密切相關[17]。分子對接研究發現，緩衰方有效活性成分和靶點蛋白的結合較好，其中PTGS-2與活性成分的結合能絕對值最高。PTGS-2是人體重要的炎癥介質，CKD尿毒癥毒素的蓄積刺激炎癥介質的表達，進而導致PTGS-2等炎癥介質表達上調，促使PTGS-2基因編碼COX-2蛋白，引起血管鈣化，血管鈣化是CKD、CVD的共同病理改變[18-21]。研究發現，COX-2抑制劑能夠有效改善血管鈣化[22]。緩衰方的活性成分通過與關鍵靶點的結合，對CKD患者的心腎起到保護作用。研究發現，槲皮素可以抑制核因子κB（Nuclear Factor-κB，NF-κB）途徑的激活，改善尿毒癥毒素誘發的內皮細胞損傷，改善動脈粥樣硬化，從而發揮對CKD的心腎保護作用[23-25];豆甾醇、β-谷甾醇等植物甾醇類活性成分也具有較好的抗炎抗氧化作用[26]。

通過GO富集分析和KEGG信號通路富集分析發現，與炎癥相關的TNF信號通路、IL-17信號通路、PI3K/AKT信號通路、核因子κB信號通路等參與了緩衰方對CKD的心腎保護作用，提示緩衰方可能通過抑制炎癥介質的級聯反應，來達到對CKD的心腎保護作用;同時，HIF-1信號通路、血小板活化、內分泌抵抗、肌動蛋白細胞骨架的調節等信號通路也可能參與了緩衰方對CKD的心腎保護作用。低氧誘導因子（Hypoxia Inducible Factors，HIFs）對炎癥反應和血管內皮損傷有著重要的調節作用，脯氨酸羥化酶（Proline Hydroxylase，PHD）抑制劑可促進CKD患者HIFs的激活，進而對CKD的心腎起到保護作用[27-29]。有學者發現，CKD血瘀證患者存在血小板活化現象，血小板活化或聚集可激活多種信號通路，介導CKD心腎損傷[30-31]。胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）與血管功能障礙密切相關[32]。有研究表明，IR通過對內皮細胞的調節增加CKD患者發生CVD的風險，槲皮素、大黃素等中藥活性成分可以有效干預IR相關信號通路，降低CKD患者發生CVD的風險[33-34]。另外我們前期研究發現，益氣活血解毒中藥（黃芪、當歸、白花蛇舌草等）可以抑制肌動蛋白細胞骨架的重排，恢復肌動蛋白微絲的正常排布，改善CKD足細胞損傷引發的蛋白尿[35]。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學的研究方法發現，緩衰方可通過多成分、多靶點、多信號通路實現對CKD的心腎保護作用，其中一些信號通路已在前期的研究中得到驗證。后續研究中，我們將基于上述研究結果對緩衰方的心腎同治作用機制進行臨床及基礎研究，以揭示和闡明緩衰方對CKD心腎保護作用的確切機制。

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（2020-05-27收稿 責任編輯：張樂杰）