基于網絡藥理學和分子對接探討“杜仲-牛膝”藥對治療骨質疏松的分子機制

王猛 劉剛 路聊東 王東偉

摘要 目的：運用網絡藥理學和分子對接的方法探討“杜仲-牛膝”藥對治療骨質疏松的分子機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）篩選杜仲、牛膝含有的活性成分及作用靶點;利用GeneCards、DisGeNET和CTD數據庫收集骨質疏松（OP）相關靶點基因;采用Cytoscape 3.8.0軟件和STRING數據庫進行“藥物-活性成分-靶點”網絡和蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建與分析;FunRich3.1.3軟件DAVID數據庫進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG） 富集分析（P<0.05）;運用Maestro version 11.5對主要活性成分及靶點蛋白進行分子對接。結果：獲得“杜仲-牛膝”藥對治療OP的活性成分共42個和133個有效靶點;獲得251條GO生物過程和90條相關信號通路，涉及PI3K-AKT、TNF、Wnt、HIF-1、MAPK信號通路等。結論：“杜仲-牛膝”藥對可能通過調控細胞增殖、分化與凋亡、骨代謝來治療OP，具有多成分、多靶點、多系統的特點，為系統闡明“杜仲-牛膝”藥對主要成分治療OP的分子機制提供了參考。

關鍵詞 杜仲;牛膝;網絡藥理學;分子對接;骨質疏松;分子機制

Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata in the treatment of osteoporosis by network pharmacology and molecular docking.Methods：TCMSP database was used to screen the active components and action targets of Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata.We used GeneCards，DisGeNET and CTD database to collect osteoporosis（Osteoporosis，OP） related target genes; used Cytoscape 3.8.0 software and STRING database to construct and analyze the “drug-active ingredient-target” network and PPI network; FunRich3.1.3 Software DAVID database were used forGO analysis and KEGG enrichment analysis（P<0.05）; we used Maestro version 11.5 to perform molecular docking of the main active ingredients and target proteins.Results：We obtained a total of 42 active ingredients and 133 effective targets of “Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata” drug for the treatment of OP; and obtained 251 GO biological processes and 90 related signal pathways，involving PI3K-AKT，TNF，Wnt，HIF-1，MAPK signal pathway etc.Conclusion：Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata drug pair may treat OP by regulating cell proliferation，differentiation and apoptosis，and bone metabolism.It has the characteristics of multi-component，multi-target and multi-system，which provides a reference for systematically elucidating the molecular mechanism of Cortex Eucommiae-Achyranthes bidentata drug pair in treating OP.

Keywords Cortex Eucommiae; Achyranthes bidentata; Network pharmacology; Molecular docking; Osteoporosis; Molecular mechanism

中圖分類號：R285.6文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.002

骨質疏松癥（Osteoporosis，OP）是最常見的骨骼疾病，是以全身性骨量減少，骨的微觀結構退化為特征，表現為單位體積的骨量降低，礦鹽和骨基質比例減少，生物脆性上升，導致骨的力學強度衰減，骨折風險上升的一種全身性骨代謝疾病[1]。2001年美國國立衛生研究院（USA National Institutes of Health，NIH）將其定義為以骨折風險概率增加和骨的生物力學強度下降為特征的骨骼疾病，并提示骨量降低是骨質疏松性骨折的主要危險因素，但還存在其他危險因素。我國OP的總患病率為6.6%～19.3%，平均為13%，其中約20%的患者會發生骨質疏松性骨折[2]。許多臨床研究結果表明，臨床上常用的抗OP的西藥均具有一定的不良反應，如長期使用激素治療的患者，其患骨壞死、冠心病、乳腺癌等疾病的概率將有不同程度的升高[3]。骨質疏松的臨床癥狀與中醫疾病“骨痿”中的“不通則痛”“腰脊不舉”“兩足軟弱”“不任其身”等表現相符。中醫以“骨痿”論治骨質疏松，重溫補腎陽、強筋壯骨，兼以通經活絡、祛風除濕、補氣養血[4]。

杜仲味辛、平，性甘、溫，無毒，具有補肝腎，強筋骨，安胎等功效，《本草會言》曰：“腰膝之痛，非杜仲不除……補肝益腎，誠為要藥?！迸Ｏノ犊?、酸，性甘平，主逐瘀通經，補肝腎，強筋骨，《醫學衷參西錄》認為：“牛膝為補益之品而善引氣血下注，故善治腎虛腰痛，或腿痿不能任地?！監P的主要病機在“腎虛”，腎為先天之本，人體的生長壯老皆由腎氣的盛衰所主導[5]。而杜仲、牛膝補益肝腎、壯腰膝、強筋骨的功效顯著，其藥性溫和、不易產生不良反應，是治療OP的優選中藥[6]。此兩藥最早配伍使用可追溯到《壽親養老新書》中“不老丸”一方?！岸胖?牛膝”藥對是治療OP的常用組方藥對，但兩藥配對應用后其多靶點作用機制尚不明確。

網絡藥理學是生物信息領域高速發展的一門新興學科，它集成了虛擬計算，高通量的基因組分析和網絡數據庫搜尋等方法，其基于系統生物學和藥物多靶標多通路理論構建“藥材-成分-靶標”網絡，分析通路機制，為藥物新方向預測和疾病的多向治療提供了導向[7]。分子對接是經由受體的特性以及受體和藥物小分子之間的互相效用形式來施行藥物設計的門徑。主要探討分子間（如配體和受體）的相互作用，并預測其連接式樣和親和力的一種理論仿效方法[8]。本研究使用網絡藥理學及分子對接技術，探討“杜仲-牛膝”藥對中有效成分與靶標蛋白之間的互作關系，研究其藥對配伍后治療OP的可能作用機制，為后續的研究驗證提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 藥材中所含活性成分的篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）以“杜仲”“牛膝”為關鍵詞，搜索杜仲、牛膝中含有的已知化學成分[9]。以藥物動力學原理為基礎，口服生物利用度（OB）是經口服用的藥物中所含有的有效成分或活性物質被人體吸收到達體循環的速度與程度，類藥性（DL）則是用以評價藥物分子成藥性高低的指標[10]。結合文獻研究，將OB≥30%，DL≥0.18作為篩選標準，篩選出杜仲、牛膝中的活性成分[11]。

1.2 藥物靶點的篩選及“藥物-活性成分-靶點”網絡的構建 將1.1項下篩選出的活性成分導入TCMSP數據庫中進行檢索，查找出藥物靶標蛋白，通過Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）進行靶標蛋白以及基因信息的校正。將藥物活性成分、靶點蛋白導入Cytoscape 3.8.0軟件，構建“藥物-活性成分-靶點”網絡并進行顯著性分析，篩選出關鍵活性成分。

1.3 “杜仲-牛膝”治療OP的潛在作用靶點獲取 ? 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）以及Comparative Toxicogenomics Database數據庫（http：//ctdbase.org/）中以“Osteoporosis”或“OP”為關鍵詞，設定物種為“Homo Sapiens”檢索與OP相關的疾病靶點，通過韋恩圖將“1.2”中篩選出的藥物靶點與相關疾病靶點映射篩選出共同靶點，從而確定“杜仲-牛膝”藥對治療OP的潛在作用靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡分析 將1.3項中篩選得到的治療OP潛在作用靶點導入STRING Version：11.0數據庫[12]（https：//string-db.org/），Organism（種屬）設為“Homo Sapiens（人類）”，得到PPI關系，保存數據為TSV格式。運用Cytoscape3.8.0軟件構建PPI網絡并分析篩選出核心靶點。

1.5 靶點富集分析與可視化 將“杜仲-牛膝”藥對治療OP的潛在作用靶點輸入到FunRich3.1.3軟件進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析，設定閾值為P<0.05，分別選取生物學過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、細胞組分（Cellular Component，CC）中顯著性前6的條目通過“Analysis”功能構建圖形可視化。使用DAVID 6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析[13]，設置P<0.05，通路分析選取與OP關聯的且顯著性較高的信號通路借助Omicshare（http：//omicshare.com/）進行可視化。

1.6 分子對接 將1.2項下篩選出的主要活性成分輸入到ZINC（http：//zinc.docking.org/）數據庫下載其3D結構，保存為“mol2”格式文件。將1.4項下篩選的核心蛋白靶點通過RCSB PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/）下載靶點蛋白的3D結構，保存為“pdb”格式文件，將靶點蛋白及活性成分的3D結構導入到MAESTRO version 11.5中，靶點蛋白通過“Protein preparation”套件去水、加氫生成pH值為7.0±2的小分子構象，活性成分通過“Ligprep”進行預處理，“Receptor Grid Gener”套件確定活性位點，運用“Ligand Docking”面板進行分子對接，對接方式為半柔性對接，以對接評分“Docking Score”評價“杜仲-牛膝”藥對主要活性成分與靶點蛋白的結合情況。

2 結果

2.1 藥物中主要化學成分的篩選 檢索得到“杜仲-牛膝”藥對中共290個化合物（5個為共有化合物），其中杜仲119個，牛膝176個。篩選出42個活性化合物，其中25個來自杜仲，20個來自牛膝，3個為共有化合物。見圖1?！岸胖?牛膝”藥對中部分活性化合物基本信息見表1。

2.2 “藥物-活性成分-靶點”網絡的構建與分析 ? 該網絡共有177個節點，其中包含2個藥物節點、42個活性成分節點和133個靶點節點，共有885條邊。其中藍色菱形代表杜仲、牛膝，黃色三角形代表活性成分，紅色箭頭代表靶點，每條邊表示節點之間的相互作用關系。見圖2。借助“Network Analyze”功能對網絡進行拓撲屬性分析。篩選度值（Degree）較大的節點進行分析，這些節點在網絡中起到了樞紐作用，可能是關鍵化合物或靶點。該網絡中活性成分的平均度值為21.07。從活性成分方面分析，有51%的活性成分作用靶點≥21個，其中槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、漢黃芩素、刺桐靈堿、豆甾醇分別能與20個以上的靶點蛋白發生作用，這些可能是“杜仲-牛膝”藥對中治療OP的主要物質基礎。

2.3 “杜仲-牛膝”藥對治療OP的潛在作用靶點 ? 基于GeneCards收集到26個OP靶點，DisGeNET收集到63個，CTD收集到820個，三者合并去重后篩選共得到847個OP相關靶點，將“杜仲-牛膝”藥對調控靶點和OP疾病靶點經過Venny在線平臺（http：//www.interactivenn.net/）分析后，獲得74個交集靶點，即為藥物治療OP的潛在作用靶點。見圖3。

2.4 PPI網絡拓撲分析 圖4顯示該網絡共有74個節點、856條邊，平均節點度值為23.14，圖中節點的大小、顏色和度值是正相關關系，節點的度值越大，顯示的節點越大且顏色越深。度值越大說明與其他蛋白相互作用更強一些，可能在發揮生物學功能中起著重要的作用。度值排名前10的靶點為白細胞介素6（IL6）、腫瘤壞死蛋白P53（TP53）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、腫瘤壞死因子（TNF）、JUN蛋白（JUN）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、表皮生長因子（EGF）、過氧化氫合成酶2（PTGS2）、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8），這些靶點可能是“杜仲-牛膝”藥對發揮治療OP功效的關鍵靶點。

2.5 靶點富集分析 通過FunRich3.1.3軟件共篩選得到GO條目343個（P<0.05），其中BP條目251個，MF條目64個，CC條目28個。其中BP主要涉及序列特異性DNA結合轉錄因子活性的正調控、細胞增殖的負調控、凋亡過程的負調控、細胞增殖、凋亡過程、血管生成等;MF主要涉及蛋白質結合、酶結合、蛋白質均二聚活性、ATP結合、鋅離子結合等方面;CC方面主要涉及核、細胞質、細胞外空間、胞質溶膠、質膜等方面。各類別前6的條目見圖5。

通過DAVID數據庫篩選得到90條（P<0.05）KEGG富集信號通路。主要涉及癌癥信號通路、鈣信號通路、PI3K-AKT、TNF、Wnt、cAMP、HIF-1等信號通路。富集顯著性前30的信號通路見圖6?？v軸代表通路名稱，橫軸代表富集因素的百分比;氣泡的大小和顏色分別代表富集靶點數和P值，顏色越紅P值越小。杜仲-牛膝”藥對和“PI3K-AKT信號通路的交集靶點見圖7。

2.6 分子對接 選取PPI網絡中度值排名前3的靶點蛋白，分別為IL6、TP53、VEGFA，與“藥物-活性成分-靶點”網絡中度值排名前3的活性成分，分別為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚，利用Maestro Version 11.5軟件進行分子對接。見表2。Docking Score的絕對值越大，化合物與靶點結合力越強，分子構象越穩定。根據對接分數大小評判，絕對值>4.25代表結合活性一般，絕對值>5.0代表結合活性比較好，絕對值>7.0代表結合活性較強[14]。分子對接結果顯示IL6與槲皮素、山柰酚的親和力最強，山柰酚與VEGFA的結合能力最強。圖8可以觀察到藥物活性成分與靶點蛋白相結合的具體位點，黃色連線為二者之間的氫鍵相互作用力，為促使分子結合到活性位點的主要作用力。

3 討論

隨著人口老齡化進程的加速，OP的發病率緊隨心血管病、糖尿病，已躍居至慢性疾病的第3位，成為世界的常見病和多發病[15]?，F代醫學對OP的治療主要為雌激素替代療法，但雌激素的長期使用會增加乳腺癌、冠心病等疾病的患病概率，其他臨床上使用的化學合成藥物均存在一定的不良反應[16]。而中藥治療OP具有不良反應小、療效明確、經濟負擔小的特點。中醫學認為OP歸屬于“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范疇。腎主骨生髓，腎精充盈，則骨髓生化有源，腎氣虧虛，則骨髓失養。由此，腎精虧損是該病的主要病機。而肝主筋，約束骨骼;脾主百骸，榮養四肢關節;因此骨質疏松的發病機制以腎虛為本，與肝虛、脾虛、血瘀密切相關[17]。杜仲、牛膝均可補肝腎，強筋骨。用于肝腎不足，腰膝酸痛，筋骨無力?，F代研究發現，杜仲的化學成分主要有黃酮類、苯丙素類化合物以及多種氨基酸和微量元素，具有抗疲勞、抗骨質疏松等多種藥理作用[18]。

根據網絡藥理學分析結果可以看出，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、黃芩素、刺桐靈堿、小檗堿是“杜仲-牛膝”藥對中主要的活性成分?；诜肿訉幽M其結合活性，結果顯示槲皮素、山柰酚與IL6、TP53、VEGFA對接均具有較好的結合活性。槲皮素和山柰酚均為黃酮類化合物。鄭紅等[19]研究表明，槲皮素能夠有效促進成骨分化，并通過上調BMP2和Smad4的表達改善OP。小鼠模型經槲皮素處理后測定骨質，發現其骨鈣素含量上升，骨源性堿性磷酸酶（NBAP）及雌二醇的含量減少[20]。山柰酚能夠增加骨密度，改善骨微結構，實驗研究表明Ca2+代謝可被高劑量的山柰酚所影響，通過調節代謝平衡來促進構造蛋白質生成，改善骨小梁丟失以達到治療骨質疏松的目的[21]。付方勝等[22]認為黃芩素可以抑制破骨細胞的形成以及抑制破骨細胞的骨吸收功能，從而預防OP的發生。并且在一定程度上減緩骨流失并部分恢復骨量，同時在體外可以促進骨髓間充質干細胞（BMMSCs）的增殖和成骨分化[23]。小檗堿可以促進p-AKT蛋白的表達，并通過激活PI3K/AKT信號通路來促進前成骨細胞的分化與礦化[24]。

本研究通過對“杜仲-牛膝”藥對治療OP的PPI網絡分析，發現IL6、TP53、VEGFA、TNF、JUN、MAPK1、EGF、PTGS2、EGFR、MAPK8等靶點是“杜仲-牛膝”藥對治療OP的主要作用靶點。其中IL6在成骨偶聯過程中發揮多重作用，成骨細胞與單核細胞均可合成IL6，IL6被合成后又直接作用于破骨細胞和成骨細胞，影響破骨細胞的活性，加速了OP的發生與發展[25]。VEGFA通過激活MAPK通路可以誘導BMSCs向成骨細胞分化，促進了成骨。TNF屬于炎癥介質，它可以刺激破骨細胞分化形成，促進分解代謝和骨細胞的破壞，是導致OP的重要環節[26]。TP53基因是一種腫瘤相關轉錄因子，在細胞應激活動中起重要作用。它通過激活多種細胞保護途徑，誘導細胞凋亡，調節細胞周期，參與成骨破骨過程[27]。EGF稱為表皮生長因子，Vary等[28]研究發現，成骨分化中的標志基因血清堿性磷酸酶和Ocn的表達可被EGF抑制，說明EGF可能影響成骨分化的負調控。JUN屬于JUN蛋白家族中的一種，而JUN蛋白是轉錄因子激活蛋白-1（Activatorprotein1，AP-1）家族中4個亞家族中的1個，研究發現AP-1可通過調節相關基因表達，來影響細胞的凋亡過程，促進細胞凋亡，加快破骨前體細胞向破骨細胞分化[29-30]。MAPK1、MAPK8均屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，其可通過對成骨細胞增殖和分化過程的促進，進而誘導血管內皮細胞的形成來發揮對OP的防治作用[31]。EGFR是ERK2的上游信號分子，具有酪氨酸激酶活性，可以通過與表皮生長因子組合，啟動細胞核內基因，從而促進細胞分裂[32]。

KEGG通路富集分析得到與OP較為相關的通路有PI3K-AKT、TNF、Wnt、HIF-1、MAPK信號通路。研究表明，PI3K-AKT信號通路參與骨質疏松、骨性關節炎、骨壞死等病理性骨病，并參與調控破骨細胞和成骨細胞的增殖、分化及凋亡[33]。正常生理情況下，PI3K-AKT信號通路可以選擇性的影響成骨細胞和破骨細胞的生理功能，保護骨小梁結構，降低破骨細胞分化，通過降低Caspases-9活性，從而減輕細胞損傷所致的細胞凋亡，影響破骨細胞形成[34]。腫瘤壞死因子（TNF）信號通路具有調節破骨細胞活性及骨吸收的作用，其中分離出的糖蛋白骨保護素（Osteoprotegerin，OPG）對骨也具有積極的保護作用[35-36]。Wnt信號通路可以通過抑制MSCs向軟骨和成脂譜系的分化，來增強成骨細胞譜系分化[37-38]。成骨細胞和骨細胞的Wnt信號通過OPG的分泌從而間接抑制破骨細胞的分化和骨吸收[39]。Wnt信號通路直接或間接地對成骨細胞和破骨細胞進行調控，在控制骨量與OP的發生發展方面具有重要作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學和分子對接相結合的方法，篩選出“杜仲-牛膝”藥對治療OP的活性成分，關鍵靶點和信號通路，發現“杜仲-牛膝”藥對可能通過調控細胞增殖、分化與凋亡、骨代謝來治療OP，具有多成分、多靶點、多系統的特點，并基于分子對接初步模擬其可能的分子作用機制，為“杜仲-牛膝”藥對治療OP機制研究提供了理論依據和線索。鑒于網絡藥理學及分子對接技術的局限性，其預測結果還需要進一步的研究驗證。

參考文獻

[1]梁偉喬，鐘誠，李宇明.骨質疏松癥的中醫病因病機認識與治療進展[J].中國骨質疏松雜志，2020，26（1）：135-139.

[2]白璧輝，謝興文，李鼎鵬，等.我國近5年來骨質疏松癥流行病學研究現狀[J].中國骨質疏松雜志，2018，24（2）：253-258.

[3]單祎娜，王莉.骨質疏松癥診斷和治療進展[J].醫學綜述，2019，25（18）：3652-3656，3661.

[4]向益，鄭烽，王顯.淺析骨質疏松癥的中醫病名[J].內蒙古中醫藥，2019，38（1）：92.

[5]元唯安.中藥新藥研發關鍵問題思考——以骨質疏松癥為例[J].中國新藥雜志，2020，29（16）：1836-1840.

[6]高衛輝，吳芬芬，段小青，等.杜仲-牛膝藥對干預去卵巢骨質疏松大鼠雌二醇和骨密度的影響實驗研究[J].中南藥學，2016，14（8）：820-823.

[7]Zhang GB，Li QY，Chen QL，et al.Network pharmacology：a new approach for chinese herbal medicine research[J].Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013：621423.

[8]Saikia S，Bordoloi M.Molecular docking：challenges，advances and its use in drug discovery perspective[J].Curr Drug Targets，2019，20（5）：501-521.

[9]Hu AN，Liu JF，Zan JF，et al.Network pharmacology deciphering multiple mechanisms of volatiles of Wendan granule for treatment of senile dementia[J].Clin J Pharmacol Toxicol，2018，32（4）：285-286.

[10]Xu X，Zhang C，Li P，et al.Drug-symptom networking：Linking drug-likeness screening to drug discovery[J].Pharmacol Res，2016，103：105-113.

[11]Wishart DS，Knox C，Guo AC，et al.DrugBank：a knowledgebase for drugs，drug actions and drug targets[J].Nucleic Acids Res，2008，36（Database issue）：D901-906.

[12]von Mering C，Jensen LJ，Snel B，et al.STRING：known and predicted protein-protein associations，integrated and transferred across organisms[J].Nucleic Acids Res，2005，33（Database issue）：D433-437.

[13]Dennis G Jr，Sherman BT，Hosack DA，et al.DAVID：database for annotation，visualization，and integrated discovery[J].Genome Biol，2003，4（5）：P3.

[14]張英睿，干志強，劉紫軒，等.基于網絡藥理學和分子對接的清開靈注射液治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的作用機制探尋[J].中草藥，2020，51（12）：3201-3210.

[15]范勛奇，石磊.骨質疏松癥相關研究進展[J].廣東化工，2020，47（2）：63-64，76.

[16]Zhao H，Zhao N，Zheng P，et al.Prevention and treatment of osteoporosis using chinese medicinal plants：special emphasis on mechanisms of immune modulation[J].J Immunol Res，2018，2018：6345857.

[17]張倩，王花欣，王媛，等.中藥防治絕經后骨質疏松癥的研究進展[J].中國骨質疏松雜志，2020，26（7）：1083-1088.

[18]潘穎宜，邢蘊蘊，王健英，等.杜仲骨保護的作用機制研究進展[J].中華中醫藥學刊，2020，38（3）：92-95.

[19]鄭紅，唐薇，角建林，等.槲皮素通過促進成骨分化治療去勢骨質疏松癥大鼠的分子機制[J].中藥藥理與臨床，2017，33（5）：16-20.

[20]卞偉，孫宏，劉凱，等.槲皮素對骨質疏松大鼠骨生物力學性能及骨代謝的影響[J].吉林中醫藥，2016，36（8）：814-817.

[21]王雪峰，楊松，曹立新，等.山奈酚對卵巢去勢大鼠的促骨膠原生成和減少骨小梁丟失的保護作用研究[J].中國臨床藥理學雜志，2020，36（10）：1302-1305.

[22]付方勝，丁佳昕，邵思遠，等.黃芩素抑制RANKL誘導的破骨細胞分化和功能[J].錦州醫科大學學報，2019，40（2）：18-20，118，119.

[23]桂林源.黃芩中小分子化合物對雌激素缺乏骨質疏松的預防和治療作用的研究[D].西安：第四軍醫大學，2016.

[24]江健，廖莉婭，容嬋，等.鹽酸小檗堿通過PI3K/Akt信號通路促進小鼠前成骨細胞MC3T3-E1的分化[J].中國病理生理雜志，2018，34（10）：1869-1875.

[25]許環順，候平，邢忠，等.鮭魚降鈣素對骨質疏松癥患者血清胰島素樣生長因子-1、白介素-6和腫瘤壞死因子-α的影響[J].疑難病雜志，2018，17（9）：914-917，921.

[26]尹偉，楊斌輝，張波，等.骨質疏松癥合并膝骨性關節炎患者骨密度及血清骨代謝指標、炎癥因子水平研究[J].中國骨質疏松雜志，2019，25（8）：1121-1124.

[27]周旭艷，歐陽桂芳，牧啟田，等.TP53突變骨髓增生異常綜合征患者的臨床特征及染色體核型分析[J].中國實驗血液學雜志，2019，27（3）：872-876.

[28]Vary CP，Li V，Raouf A，et al.Involvement of Ets transcription factors and targets in osteoblast differentiation and matrix mineralization[J].Exp Cell Res，2000，257（1）：213-222.

[29]劉佳佳，李平，鄧琦，等.在Prrx1+骨髓間充質干細胞中過表達肝素結合表皮生長因子樣生長因子抑制小鼠骨發育[J].中國組織工程研究，2019，23（29）：4623-4628.

[30]劉夢楠.CaMKⅡδ過表達對破骨細胞分化中c-fos、c-jun基因表達的影響[D].唐山：華北理工大學，2019.

[31]陳鎮秋，洪郭駒，韓曉蕊等.骨科祛痰逐瘀方經MAPK/ERK通路誘導血管內皮細胞遷移與血管管腔形成[J].中國骨質疏松雜志，2019，25（6）：747-752.

[32]楊世春，溫本，黃小區，等.探討ERα/EGFR在雙膦酸鹽對絕經前后乳腺癌療效差異中的作用[J].中國處方藥，2019，17（8）：142-143.

[33]Lin C，Shao Y，Zeng C，et al.Blocking PI3K/AKT signaling inhibits bone sclerosis in subchondral bone and attenuates post-traumatic osteoarthritis[J].J Cell Physiol，2018，233（8）：6135-6147.

[34]強勝林，劉濤，賈永龍，等.補腎固本方對大鼠骨質疏松模型中PI3K/AKT/mTOR信號通路表達的調控研究[J].中國骨質疏松雜志，2020，26（7）：983-987.

[35]田愛現，馬劍雄，馬信龍.骨質疏松關聯性分子信號通路及其臨床應用[J].中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志，2019，12（3）：282-291.

[36]Simonet WS，Lacey DL，Dunstan CR，et al.Osteoprotegerin：a novel secreted protein involved in the regulation of bone density[J].Cell，1997，89（2）：309-319.

[37]Long H，Zhu Y，Lin Z，et al.miR-381 modulates human bone mesenchymal stromal cells（BMSCs） osteogenesis via suppressing Wnt signaling pathway during atrophic nonunion development[J].Cell Death Dis，2019，10（7）：470.

[38]Yuan Z，Li Q，Luo S，et al.PPARγ and Wnt signaling in adipogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells[J].Curr Stem Cell Res Ther，2016，11（3）：216-225.

[39]王琰，王艷.Wnt信號通路在周圍神經損傷后骨質疏松中的研究進展[J].中國康復理論與實踐，2020，26（8）：930-935.

（2020-08-27收稿 責任編輯：魏慶雙，徐穎）