一株野生血紅小菇的分離鑒定及液體培養基配方篩選

郭興 高智濤 范冬茹 張德巖 劉繼云 高云虹

摘要 血紅小菇（Mycena haematopus（Pers.）P.Kumm.）是珍稀藥用真菌，具有多種功能作用。液體菌種是血紅小菇產業邁入標準化、規?；?、工廠化的必由之路，而碳源、氮源、無機鹽、維生素對血紅小菇液體培養擴繁菌絲體具有重要影響。通過單因素試驗和正交試驗相結合，對菌絲含量進行測定，了解菌絲生長情況和各種參數之間的關系。結果顯示，血紅小菇液體最佳培養基配方為玉米粉40 g/L、蛋白胨4 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4 0.7 g/L、NaCl 0.2 g/L、VB1 0.001%、pH 6.5。

關鍵詞 血紅小菇;液體培養基;發酵

中圖分類號 S646? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）22-0065-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.22.016

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Isolation and Identification of a Wild Mycena haematopus sanguineus and Screening of Its Liquid Medium

GUO Xing，GAO Zhi-tao，FAN Dong-ru et al

（Yichun Branch of Heilongjiang Academy of Forestry，? Yichun， Heilongjiang 153000）

Abstract Mycena haematopus（Pers.）P. Kumm is a rare medicinal fungus with multiple functions. Liquid strain is the only way for the industry of Pleurotus sanguineus to be standardized， large-scale and industrialized. Carbon source， nitrogen source， inorganic salt and vitamin have an important influence on the liquid culture and propagation of mycelium of Pleurotus sanguineus.The content of hyphae was determined by combining single factor test and orthogonal test to understand the growth of mycelium and the relationship between the mycelium and various parameters. The results showed that the best liquid medium formula of Pleurotus eryngii was corn flour 40 g/L， peptone 4 g/L， KH2PO4 1 g/L， MgSO4 7 g/L， NaCl 0.2 g/L， VB1 0.001%， pH 6.5.

Key words Mycena haematopus（Pers.）P. Kumm.;Liquid medium;Fermentation

血紅小菇（Mycena haematopus（Pers.）P.Kumm.），又名血柄小菇、紅葉小菇，為擔子菌亞門（Basidiomycotina）、傘菌目（Agaricales）、白蘑科（Tricholomataceae）、小菇屬（Mycena）的腐生菌[1]。初夏至秋季常簇生于腐朽程度較深的闊葉樹腐木上，分布于東北、華中等地區。菌蓋直徑2.5～5.0 cm，幼時圓錐形，逐漸變為鐘形，具條紋;幼時暗紅色，成熟后稍淡，中部色深，邊緣色淡且常開裂呈規則的鋸齒狀;幼時有白色粉末狀細顆粒，后變光滑，傷后流出血紅色汁液。菌肉薄，白色至酒紅色。菌褶直生或近彎生，白色至灰白色，有時可見暗紅色斑點，較密。菌柄長3～6 cm，直徑2～3 cm，圓柱形或扁，等粗，與菌蓋同色或稍淡，被白色細粉狀顆粒，空心，脆質，基部被白色毛狀菌絲體[2]。擔孢子（7.7～11.1）×（5.8～6.9） μm，Q=1.3～1.8，Qav=1.5 橢圓形至長橢圓形，無色，光滑，薄壁，內含油滴，淀粉質[3]。試驗證明血紅小菇具有抗癌作用，對小白鼠肉瘤180和艾氏癌的抑制率均高達100%。為了使血紅小菇產業邁入標準化、規?；?、工廠化，研究液體菌種生產勢在必行。液體菌種具有接種方便快速、發菌快、菌齡一致、制種周期短等優點，可以快速提取獲得藥效成分，提高生產效率，因此具有廣闊的應用前景[4-6]。鑒于此，筆者對血紅小菇進行液體培養基配方的篩選，旨在為實際生產提供理論的指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。

野生血紅小菇于2020年8月22日采自黑龍江伊春興安國家森林公園內，編號為YCMH-1。

1.1.2 培養基。

斜面培養基：去皮馬鈴薯 200.0 g、葡萄糖 20.0 g、瓊脂 20.0 g，純水定容至 1 000 mL[7]。

液體培養基：葡萄糖 30 g/L、蛋白胨3 g/L、硫酸鎂0.05 g/mL、磷酸二氫鉀1 g/mL[8]。

1.1.3 試劑。

試驗所使用的主要化學試劑均為國產分析純或食品級：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸銨、KH2PO4、MgSO4、CaCO3、FeSO4、ZnSO4、NaCl、HCl、NaOH、VC、VB1、VB2、VB6。玉米粉、黃豆粉經烘干粉碎過100目。

1.1.4 儀器與設備。

主要儀器設備有超凈工作臺（東莞雅寧凈化科技有限公司）、電熱鼓風干燥箱（廣州市旭朗機械設備有限公司）、BSD-YF3200智能精密型搖床（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）、YXQ-30SII高壓滅菌器（濟南杰島分析儀器有限公司）、AUW120D電子天平（日本島津）。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與接種。

制作試管斜面培養基，滅菌條件設置為121 ℃、30 min;將保藏的菌種進行活化，無菌條件下進行擴繁，放入（25±1）℃的恒溫培養箱內進行培養[9]。

在無菌條件下，取血紅小菇菌種的10個菌塊接入到盛有150 mL液體培養基的250 mL三角瓶中，在搖床上以25 ℃、150 r/min的條件培養20 d[10]。

1.2.2 ITS序列分析。

將純化后的試管菌種送生工生物工程（上海）股份有限公司進行ITS全序列測定。采用SK8259（真菌）試劑盒提取基因組DNA，選用真菌鑒定通用引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增[11]。采用25 μL PCR反應體系：Template（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL;10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL;dNTP（各2.5 mmol/L）1.0 μL;Taq酶0.2 μL;F（10 μmol/L）0.5 μL;R（10 μmol/L）0.5 μL;加雙蒸水至25 μL。反應程序為94 ℃預變性4 min，（94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min）30個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。將測得的ITS序列用DNAMAN進行拼接，將ITS序列提交GenBank數據庫進行BLAST比對[12]。

1.2.3 生物量測定方法。

菌絲體生物量的測定如下：取培養結束的血紅小菇液體培養基，將培養基和菌絲體一起倒入濾網上，并用純水反復沖洗，再將菌絲體置于培養皿中，放入70 ℃烘箱中至恒重后，稱重[13]。

1.2.4 液體發酵培養基的優化。

進行適宜碳源、氮源、無機鹽、維生素、pH的篩選，每試驗重復3次。

1.2.4.1 碳源試驗。

在配置液體培養基時，使用碳源分別為30 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉進行碳源單因素試驗。

將篩選出的最佳碳源按含10、20、30、40、50 g/L，分別配制液體培養基，進一步篩選碳量試驗。

1.2.4.2 氮源試驗。

在配置液體培養基時，使用氮源分別為3 g/L的蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸銨、黃豆粉進行氮源單因素試驗。

將篩選出的最佳氮源按含1、2、3、4、5 g/L，分別配制液體培養基，進一步篩選氮量試驗。

1.2.4.3 無機鹽及不同添加量試驗。

在配置液體培養基時，使KH2PO4的添加量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L。

在配置液體培養基時，使MgSO4的添加量分別為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g/L。

另配制5組液體培養基，額外分別添加0.3 g/L FeSO4、CaSO4、NaCl、ZnSO 并與空白液體培養基進行比較。

1.2.4.4 維生素試驗。

在液體培養基中分別添加0.001% 的VC、VB1、VB2、VB6。

1.2.4.5 pH試驗。

用HCl、NaOH將液體培養基的 pH 分別調為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。

1.2.4.6 正交優化。

在單因素試驗結果上，以碳源、氮源、無機鹽、維生素為影響因子，建立 L9（34）正交表（表1）。

1.2.5 數據處理及統計分析。

采用Excel 2010、SPSS 10.0進行數據處理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 野生血紅小菇的形態特征

所采集的YCMH-1為血紅小菇（圖1），菌蓋直徑2.8 cm，鐘形，具條紋;幼時暗紅色，成熟后稍淡，中部色深，邊緣色淡且常開裂呈規則的鋸齒狀;幼時有白色粉末狀細顆粒，后變光滑，傷后流出血紅色汁液。菌肉薄，白色至酒紅色。菌褶直生或近彎生，白色至灰白色，有時可見暗紅色斑點，較密。菌柄長3～6 cm，直徑2～3 cm，圓柱形或扁，等粗，與菌蓋同色或稍淡，被白色細粉狀顆粒，空心，脆質，基部被白色毛狀菌絲體。

2.2 血紅小菇的菌株鑒定及系統發育

菌株擴增的ITS片段經測序得到一個長度為661 bp的序列（TGCGGAAGGAT

CATTATT-GAATACGATTGGGACTGATGCTGGCTCTTCACTG-

AGCATGTGCTCGTCTCATCTATTTATCTTCTCTTGTGCACAT-

CTTGTGGTCTTGAATTGAAACCTTTCGCATTCGTGCGGTTTG-

GGAGATTGTTAAACCTTCTCCTGCTTCATTCAAGGTCATGTT-

TTCATATACACTATAAAGTTACAGAATGTCTTTTAACGATTG-

CGCTTGTCGTAGTCATTAAACCTATACAACTTTCAGCAACG-

GATCTCTTGGCTCTCCTATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG-

CGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAA-

TCTTTGAACGCACCTTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCA-

TGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTATCAACCTTGCTCGCTTT-

TACTAGCTTGAGTTAGGCTTGGATGTGAGGGCTTGCTGGCT-

TCCTTCAGTGGATGGTCTGCTCCCTTTAAATACATTAGTGGG-

ATCTCTTGTGGACCGTCACTTGGTGTGATAATTATCTATGCC-

TTGAGACTTTGAAGCAAACTAATGGGAATCCGCTTATAACC-

GTCTTCGGACAATTAATGACTATTTGACCTCAAATCAGGTA-

GGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATC），電泳見圖2。

將此結果在NCBI 上BLAST比對，結果見表2。由表2可知，最大匹配值為1 114～1 21 對比程度大;覆蓋率最高可達100%;E值為0，說明對比完成匹配;相似性為99.39%～99.85%，表明對比結果相似性極高。綜合得出，在10個對比結果中，YCMH-1與10組血紅小菇（Mycena haematopus）相似程度較高，可以初步確定YCMH-1為血紅小菇。

2.3 碳源試驗結果

從表3可以看出，血紅小菇菌絲體以玉米粉為碳源的吸收利用效果顯著高于其他碳源，菌絲體生物量達到6.6 g/L，與其他組存在顯著性差異。添加蔗糖的菌絲生物量次之，為4.5 g/L。因此，玉米粉為血紅小菇液體培養基的最佳碳源。

將篩選出的最佳碳源玉米粉按含10、20、30、40、50 g/L分別配制液體培養基，開展進一步篩選碳量試驗。從圖3可以看出，當培養基中玉米粉添加量在10～40 g/L時，菌絲體生物量逐漸增加，在玉米粉添加量為40 g/L時，菌絲體生物量達到最大，為7.8 g/L。而當玉米粉添加量繼續增加到5 g/L時，菌絲體生物量反而下降。

2.4 氮源試驗結果

從表4可以看出，血紅小菇菌絲體以蛋白胨為氮源的吸收利用效果好于其他4種氮源，菌絲體生物量為4.1 g/L;另外血紅小菇菌絲體對酵母膏的利用效果也較好，菌絲體生物量為3.6 g/L;而對尿素和硫酸銨幾乎不能利用。因此，蛋白胨為血紅小菇液體培養基的最佳氮源。

將篩選出的最佳氮源蛋白胨按含1、2、3、4、5 g/L分別配制液體培養基，進一步篩選氮量試驗。從圖4可以看出，當培養基中蛋白胨濃度在1～4 g/L時，菌絲體生物量逐漸增加，在蛋白胨添加量為4 g/L時，菌絲體生物量達到最大，為4.8 g/L。而當蛋白胨添加量繼續增加到5 g/L時，菌絲體生物量反而下降。

2.5 無機鹽及其添加量試驗結果

從圖5可以看出，血紅小菇菌絲體的生物量隨KH2PO4添加量的逐漸增加出現先增加后降低現象，在KH2PO4添加量為0.5～1.0 g/L時，血紅小菇菌絲體的生物量隨KH2PO4添加量的逐漸增加而提高;在KH2PO4添加量為1.0 g/L時，菌絲體生物量最多，為4.1 g/L;而在KH2PO4添加量為1.0～2.5 g/L時，血紅小菇菌絲體的生物量隨KH2PO4添加量的逐漸增加而降低。因此，血紅小菇液體培養基中KH2PO4的最佳添加量為1.0 g/L。

從圖6可以看出，當MgSO4添加量在0.1～0.3 g/L時，血紅小菇的菌絲體生物量隨KH2PO4添加量的變化不大;當MgSO4添加量在0.3～0.7 g/L時，血紅小菇的菌絲體生物量隨KH2PO4添加量的逐漸增加而提高;當MgSO4添加量在0.7 g/L時，血紅小菇的菌絲體生物量達到最大，為4.2 g/L;當MgSO4添加量在0.7～0.9 g/L時，血紅小菇的菌絲體生物量隨KH2PO4添加量的逐漸增加而降低。因此，血紅小菇液體培養基中MgSO4的最佳添加量為0.7 g/L。

從表5可以看出，在各無機鹽濃度均為0.3 g/L時，添加了NaCl的血紅小菇菌絲體生物量為6.1 g/L，另外添加了FeSO4、CaCO3的血紅小菇菌絲體生物量分別為4.4和4.2 g/L，均高于空白對照的4.1 g/L，而添加了ZnSO4的菌絲體生物量僅為0.3 g/L，對血紅小菇菌絲體的生長有抑制作用。因此，血紅小菇液體培養基中NaCl為最佳無機鹽。

2.6 不同維生素對發酵的影響

由表6可以看出，在各維生素濃度均為0.001%時，添加VB1對血紅小菇菌絲體生長具有促進作用，效果顯著高于其他維生素，血紅小菇菌絲體生物量為5.1 g/L;其次為添加VC的血紅小菇菌絲體生物量為4.4 g/L;而添加了VB2、VB6的血紅小菇菌絲體生物量低于空白對照，表明VB2、VB6血紅小菇菌絲體生長有抑制作用。因此，血紅小菇液體培養基中VB1為最佳維生素。

2.7 pH對發酵的影響

從圖7可以看出，血紅小菇菌絲體在pH 6.0～8.0時均可以生長。pH 6.5時菌絲生長速度最快，菌絲體生物量最多，為4.4 g/L，培養液顏色澄清、菌絲球生長勢強、大小均勻;pH 7.0時菌絲生長情況較好;當pH在6.0～6.5時，菌絲體生物量隨著pH的升高而提高;當pH在6.5～8.0時，菌絲體生物量隨著pH的升高而降低;在pH<6.5和pH>7.5時，菌絲體生物量均低于空白對照。因此，血紅小菇液體培養基的最佳pH為6.5。

2.8 優化正交試驗

選取碳源為玉米粉，氮源為蛋白胨，無機鹽為NaCl，維生素為VB1作為影響因子，建立L9（34）正交表，KH2PO4和MgSO4添加量分別1和0.7 g/L。

從表7可以看出，對菌絲體生物量影響最大的是碳源，其次是氮源，再次是無機鹽，最后是維生素，最佳組合是A3B3C2D 即玉米粉40 g/L、蛋白胨4 g/L、KH2PO4 1? g/L、MgSO4 0.7 g/L、NaCl 0.2 g/L、VB1 0.001%。

3 結論與討論

隨著科技的進步，工廠化生產將成為食用菌產業發展的新方向，而體液菌種生產正是工廠化所必需的。

碳源和氮源是微生物生長所需的最基本營養因子[14]。碳源既是構成菌體細胞的碳骨架，也可為菌體活動提供能量來源，氮源則是菌體合成蛋白質、核酸、維生素等必需的原料[15]。

在碳源試驗中，血紅小菇菌絲體以玉米粉為碳源的吸收利用效果顯著高于其他碳源，玉米粉在食用菌液體發酵培養中的作用已被相繼報道，玉米粉為復合碳源，同時含有植物激素中的玉米素[16]、某些生長因子和氮源，營養豐富，能促進菌絲體生長[17]，另因玉米粉溶液的黏度比較大，增加了發酵液的黏性拉力，使得形成的菌絲球易被發酵液機械性拉開而小型化，產生的菌絲球數量多，而大量的生長點更有利于菌絲體生物量的積累。在碳源濃度試驗中，玉米粉的添加量為30 g/L效果最佳，當繼續增加玉米粉的濃度時，血紅小菇的菌絲生物量反而降低，分析原因可能是玉米粉的黏度過大，影響了發酵液的流動性，從而導致血紅小菇的菌絲體生物量減少[18]。

在氮源試驗中，血紅小菇對有機氮和無機氮之間的利用差異很大，可能是因為有機氮富含蛋白質、脂肪酸、維生素、游離氨基酸等，且氨基酸的種類齊全。而尿素雖然屬于有機氮，但尿素僅能給生物提供氨態氮，所以效果較差。另一方面可能是由于硫酸銨會使液體培養基的pH發生嚴重變化，影響了菌絲生長。因此，蛋白胨是血紅小菇液體培養基的最佳氮源。

在無機鹽試驗中，血紅小菇液體培養基中KH2PO4的最佳添加量為1 g/L，MgSO4的最佳添加量為0.7 g/L，另額外添加0.3 g/L的NaCl對血紅小菇菌絲生長有顯著促進作用。在維生素試驗中，血紅小菇液體培養基中添加0.001%VB 對菌絲生長有顯著促進作用。不同pH對血紅小菇菌絲的生長試驗結果表明，血紅小菇液體培養基的最佳pH為6.5。

通過單因素試驗和正交試驗相結合，對菌絲含量進行測定，了解菌絲生長情況以及和各種參數之間的關系，確定了血紅小菇液體培養基，意在為血紅小菇的工廠化、規?；?、標準化生產打下基礎。該研究顯示，血紅小菇液體最佳培養基配方為：玉米粉40 g/L、蛋白胨4 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4 0.7 g/L、NaCl 0.2 g/L、VB1 0.001%。

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