cAMP 調節劑對卵母細胞體外成熟效果的調節機制研究進展

齊雅天，房曉歡，李 颯，李俊杰,2*

（1.河北農業大學動物科技學院，河北保定 071000；2.河北省牛羊胚胎技術創新中心，河北保定 071000）

卵母細胞體外成熟（IVM）是體外胚胎生產的關鍵技術之一，對于人類輔助生殖技術和優良種畜快速擴繁具有重要意義[1]，其成熟效果直接影響著后續體外受精、體細胞核移植、轉基因、胚胎干細胞與胚胎移植等技術的效果，對于胚胎基因組激活和早期胚胎發育至關重要。卵母細胞成熟包括細胞核與細胞質成熟2 個方面[2]，但哺乳動物卵母細胞在常規IVM 培養時，易導致細胞核成熟先于細胞質成熟，造成核質成熟不同步，影響卵母細胞成熟質量[3]。研究發現，卵母細胞體內成熟時高水平的環磷酸腺苷（cAMP）是抑制核成熟的關鍵調節因子[4]。因此，常在IVM 前增加預成熟階段升高cAMP，抑制核成熟，使細胞質充分發育，有助于提高卵母細胞發育能力[5]。Zhang 等[6]研究發現，使用cAMP 調節劑可維持小鼠卵母細胞內高cAMP 水平，從而抑制核成熟，提高卵母細胞核質同步成熟效果。本文通過對卵母細胞內cAMP 的動態變化、常用cAMP 調節劑及其調節卵母細胞成熟的機制進行綜述，以期為提高卵母細胞體外成熟效果提供依據。

1 卵母細胞成熟過程中cAMP 變化及對卵母細胞體外成熟的影響

哺乳動物卵母細胞來源于胚胎期出現的卵原細胞，卵原細胞經多次有絲分裂發育為初級卵母細胞，后經2次減數分裂得到成熟的卵母細胞。在體內，卵母細胞中高濃度的cAMP 使其細胞核停滯于第1 次減數分裂前期的雙線期，稱為生發泡階段（GV）[7]。這主要是由于高濃度cAMP 激活了蛋白激酶A（PKA），進而提高了抑制卵母細胞核成熟的細胞周期蛋白依賴激酶1（CDK1）活性[8]。排卵前，在促黃體素作用下，卵丘細胞內環鳥苷酸（cGMP）濃度下降，經縫隙連接，使卵母細胞內cAMP 濃度驟降[9-10]，生發泡破裂（GVBD），恢復減數分裂，排出第一極體。這一過程受卵母細胞自分泌與周圍卵丘細胞旁分泌信號的調節[11]。然而體外培養時，GV 期卵丘卵母細胞復合體（COCs）一旦離開母體，卵丘細胞與卵母細胞之間的縫隙連接受損[12]，cAMP和cGMP 合成受阻，使卵母細胞中cAMP 濃度下降進而導致核成熟[2]。因此，卵母細胞體外培養往往由于核質發育不同步的問題造成體外卵母細胞的發育能力遠不及體內[2,9]。

另有研究表明，cAMP 對卵母細胞的代謝水平和抗氧化能力也有影響，如刺激顆粒細胞糖酵解、提高卵母細胞谷胱甘肽水平和線粒體氧化代謝功能[13-15]，這些均有助于提高卵母細胞的體外成熟質量。

2 常用cAMP 調節劑調控卵母細胞體外成熟

2.1 常用cAMP 調節劑 添加cAMP 調節劑模擬體內環境，可維持卵母細胞內高水平cAMP 以促使核質發育趨于同步，提高卵母細胞質量[16]。常用的調節劑有毛喉素（FSK）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、西洛酰胺（CIL）和C 型鈉肽（CNP）。

2.1.1 FSK FSK，又名FK，可有效提高卵母細胞中cAMP 濃度。對牛新鮮卵母細胞和玻璃化冷凍卵母細胞的研究表明，在添加FSK 的IVM 培養基中培養0.5 h后，新鮮組和玻璃化冷凍組卵母細胞cAMP 水平均有所提高，成熟培養22～26 h 時與對照組相比成熟率低，但30 h 的成熟率與對照組相比無差異，證明FSK 可延遲成熟進程，促進核質成熟同步且對成熟率并無不良影響[17]。Park 等[18]將豬COCs 在添加50 μmol/L FSK 的培養基中預成熟24 h，之后在常規IVM 培養基中成熟41～44 h，發現FSK 添加組相比于其他處理組顯著促進了孤雌激活的囊胚形成?？傊?，FSK 可通過提高cAMP水平促進卵母細胞核質同步成熟。

2.1.2 IBMX IBMX 也是一種常用的cAMP 調節劑。Kenji 等[17]研究顯示，無論是牛凍融卵母細胞還是新鮮卵母細胞，添加IBMX 培養2、4、8 h 的卵泡破裂率與對照組相比均顯著降低，證明IBMX 可以維持阻滯，提高卵母細胞發育能力，改善與冷凍保存相關的卵母細胞減數分裂和發育異常。Abdel-Ghani 等[19]將卵母細胞置于含IBMX 的培養基中預成熟0、5、10 h，結果顯示預成熟5 h的卵母細胞卵裂率和囊胚率均高于0、10 h組?？梢?，IVM 過程中添加適宜的IBMX 對于維持卵母細胞阻滯，改善發育能力有良好效果。

2.1.3 CIL CIL 提高卵母細胞cAMP 的能力已受到廣泛認可。有報道顯示，1 μmol/L 的CIL 已在小鼠[20]及人[21]卵母細胞中發揮較好效果。而綿羊IVM 培養液中添加5 μmol/L CIL 也可以延遲核成熟進程并不損害卵母細胞發育到M II 期的能力[22]。Lee 等[23]在直徑小于3 mm的豬未成熟卵泡中采集COCs，之后置于含有20 μmol/L CIL 的培養基中預成熟2 d，可顯著增加卵母細胞平均直徑。因此，使用CIL 可維持卵母細胞減數分裂阻滯，調節核成熟進程。

2.1.4 CNP CNP 是一種天然的cAMP 調節劑，可由卵泡壁層顆粒細胞產生，受體為鈉尿肽受體2（NPR2）。Soto-Heras 等[24]在牛卵母細胞預成熟階段分別添加100 nmol/L和200 nmol/L 的CNP，培養6 h 后的COCs 阻滯效果均比對照組更佳。另有研究發現，在預成熟培養基中添加CNP 可顯著提高豬卵母細胞體外受精后的卵裂率和囊胚率[25]。同樣，海日汗等[26]用200 nmol/L CNP 預成熟綿羊COCs 培養4 h 后，囊胚率顯著高于對照組。因此，CNP 可以作為良好的cAMP 調節劑促進卵母細胞成熟及隨后的胚胎發育。

2.2 cAMP 調節劑的聯合使用 在預成熟期同時添加IBMX 和FSK 在一定程度上模擬了體內由促性腺激素激增引起的cAMP 水平的升高[27]。近年，針對人類輔助生殖技術，模擬生理卵母細胞成熟（SPOM）體系成為研究熱點，該體系先在預成熟階段添加一定濃度的IBMX 和FSK，而后在IVM 期使用CIL，可延緩減數分裂進程，防止卵母細胞核早熟，顯著提高卵母細胞成熟率[28]。Hashimoto 等[29]在研究牛卵母細胞發育過程中線粒體的變化時發現，使用IBMX 和FSK 處理可誘導糖酵解、脂肪酸降解和線粒體電子運輸系統所需基因的表達，改善卵母細胞的線粒體功能和ATP 水平，且不影響成熟率。此外，Soto-Heras 等[24]在牛卵母細胞預成熟期使用IBMX 和FSK 2 種調節劑，能夠顯著提高囊胚率和妊娠率；另外，該團隊聯合使用CNP 和IBMX 可使90%以上卵母細胞維持阻滯長達6 h，比單獨使用其中任一抑制劑阻滯時間更長。

總之，添加CNP、IBMX、FSK 和CIL 等cAMP 調節劑，可以模擬生理卵母細胞成熟過程中出現的一些關鍵信號因子，通過維持減數分裂阻滯來改善卵母細胞發育，提高卵母細胞質量[14]。

3 cAMP 調節卵母細胞體外成熟的機制

3.1 cAMP 的合成與分解途徑 cAMP 的合成主要由腺苷酸環化酶（AC）催化三磷酸腺苷（ATP）生成。哺乳動物卵母細胞內cAMP 來源主要有2 個方面。主要途徑是AC 催化卵丘顆粒細胞ATP 生成cAMP，再通過縫隙連接轉運至卵母細胞內部調控減數分裂進程[30]；此外，卵母細胞內G 蛋白與受體（GPR）結合也可激活AC，通過自身Gs-GPR-AC 級聯反應加強AC 活性，催化ATP 磷酸化，使卵母細胞內cAMP 持續產生[31]。

在分解途徑中，cAMP 可被磷酸二酯酶（PDE）去磷酸化為一磷酸腺苷（AMP），AMP 再經腺苷回收途徑轉變為ATP，實現cAMP 的循環[27]。哺乳動物體內PDE 同工酶有11 種，其中PDE3 僅存于卵母細胞中[18]。研究發現，卵丘細胞生成的cGMP 可經縫隙連接擴散入卵母細胞，抑制PDE3 活性，阻止cAMP 水解以維持減數分裂阻滯[6,32]。

3.2 cAMP 調節劑調節卵母細胞成熟的機制

3.2.1 AC 激活途徑 FSK 可對AC 的生成起促進作用，是活化cAMP 生成路徑的關鍵調節劑[33]。FSK 可通過激活AC，加速ATP 轉化為cAMP 并使之累積[27]，從而有效抑制卵母細胞核成熟進程。

3.2.2 PDE 抑制途徑 CNP、IBMX、CIL 可通過抑制PDE 調節核成熟。其中，CNP 調控卵母細胞cAMP 的具體途徑隨物種而異。在小鼠中，NPR2 僅分布于卵丘細胞，CNP 只能與卵丘細胞上的NPR2 結合，產生的cGMP 經縫隙連接擴散入卵母細胞內[6]。而牛的NPR2在卵丘細胞和卵母細胞表面均有表達[15]。牛壁層顆粒細胞合成的CNP 刺激卵丘細胞NPR2 生成cGMP，通過縫隙連接轉移到卵母細胞內發揮作用；同時CNP 也可激活卵母細胞表面的NPR2，直接產生cGMP 抑制卵母細胞PDE 活性，阻止cAMP 水解，維持減數分裂阻滯[34]?？傊?，哺乳動物的CNP 大多都是經由CNP/NPR2-cGMPPDE 通路維持阻滯。IBMX 作為PDE 廣譜抑制劑（PDE8和PDE9 除 外）可以抑制PDE 活 性[35-36]。CIL 不 同于IBMX，其作為PDE3 的特異性抑制劑，通過阻止PDE3 對卵母細胞cAMP 的降解[36]，維持減數分裂阻滯。

4 存在的問題

IVM 培養基中減數分裂抑制劑和誘導劑導致的減數分裂動力學變化需嚴格平衡。雖然CNP、IBMX、FSK 和CIL 的作用效果已較為明顯，但IVM 系統極其精細，cAMP 調節因子很敏感[37]，操作不當會產生負面影響。例如預成熟階段使用的IBMX 和FSK，對卵母細胞具有一定的化學毒性，如未徹底清洗干凈，則會影響卵母細胞的減數分裂，降低其受精率和胚胎產量[38]。此外，雖然核成熟抑制劑調節卵母細胞發育能力已受廣泛認可，但某些物種體外成熟效果仍有待提高，如劉曉靜等[39]盡管證實100 nmol/L CNP 預處理12 h 可顯著提高犬卵母細胞體外成熟效果，但成熟率僅為26.9%?？梢?，現有cAMP 調節劑對卵母細胞體外成熟效果仍有待深入研究。

5 結 語

綜上，cAMP 介導的體外成熟法是一種更精細化的卵母細胞體外成熟方法，可維持卵母細胞cAMP 水平，延長核成熟進程，縮小核質發育差距，為提高體外卵母細胞發育能力提供了實踐依據。此項技術的臨床應用對于人類和動物來說具有潛在意義，但不同物種的適宜用量及處理時長等仍有待探索。