外源因子調控卵母細胞體外成熟的研究進展

孫銘菊，屈佳丹，郇延軍

（青島農業大學動物醫學院，山東青島 266109）

體外受精（in vitro Fertilization，IVF）、體細胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT）以及胚胎冷凍保存（Embryo Cryopreservation，EC）等胚胎工程技術的興起及應用極大促進了畜牧業發展，這些胚胎工程技術的進步離不開高質量成熟的卵母細胞。研究表明，卵母細胞在成熟過程中，尤其是在體外環境下，容易受到各種外源因子的影響，這些外源因子能夠調控卵母細胞成熟，決定卵母細胞成熟質量和在胚胎工程技術中的應用效果。但哪些或哪類外源因子在卵母細胞成熟過程中發揮主要作用，以及這些外源因子如何發揮作用影響卵母細胞成熟還沒有詳細概述，而且改善卵母細胞成熟質量的外源因子，尤其是抗氧化物質，尚未有效開發，同時，最新研究技術，尤其是單細胞多組學測序（Single-Cell Multi-Omics Sequencing）技術，尚未指出在外源因子調控卵母細胞成熟機理研究中的發展空間。為此，本文概述了外源有害因子和有利（抗氧化）因子對卵母細胞成熟質量的影響，指出開發健康有效提高卵母細胞成熟質量的外源因子的重要性，探討了外源因子調控卵母細胞成熟機理的最新研究方法，為創新和完善卵母細胞體外成熟培養體系提供了研究思路，進而提高動物生殖健康和加快胚胎工程技術的應用。

1 卵母細胞體外成熟及其研究意義

卵母細胞成熟需經歷2 次減數分裂過程，在體外成熟培養條件下，處于第一次減數分裂前期雙線期的卵母細胞在卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone，FSH）、促黃體生成素（Luteinizing Hormone，LH）等激素刺激下，發生生發泡破裂（Germinal Vesicle Breakdown，GVBD），恢復減數分裂，最終停滯在第二次減數分裂中期（MII），并排出第一極體，即核成熟；在卵母細胞核成熟過程中，細胞質也發生了一系列形態變化來完成胞質成熟，涉及細胞器的重新空間定位和母源物質的儲備利用等。

研究發現，體外成熟卵母細胞的發育能力低于體內成熟的卵母細胞，這可能歸因于體外成熟卵母細胞的核成熟和胞質成熟不充分。卵母細胞在體外成熟過程中，不健全的培養體系會致使卵母細胞成熟質量下降，而且各種外源因子也會作用于卵母細胞，調控卵母細胞成熟及后續發育能力。因此，通過對這些外源因子深入研究，充分揭示外源因子調控卵母細胞成熟的分子機制，將會創新和完善卵母細胞體外成熟培養體系，提升卵母細胞成熟質量，促進胚胎工程技術的廣泛應用。

2 外源因子調控卵母細胞成熟

目前，科研人員通過改變培養體系確定了大量影響卵母細胞成熟的外源因子，其中外源有害因子和有利（抗氧化）因子受到廣泛關注。

2.1 外源有害因子分類 外源有害因子即環境污染物，涉及降低卵母細胞成熟質量的物質（表1）。根據外源有害因子屬性，主要分為物理類、化學類和生物類。物理類有害因子包括熱應激（Heat Stress）、各種輻射（Radiation）等?；瘜W類有害因子是最廣泛存在的，涉及日常所接觸的塑化劑（Plasticizer）、除草劑（Herbicide）、重金屬（Heavy Metal）等。生物類有害因子主要是食物霉變所產生的毒素（Toxin）或感染的細菌、病毒及寄生蟲分泌的有害物質等。

表1 外源有害因子損傷卵母細胞成熟的潛在調控作用

2.2 外源有害因子影響卵母細胞成熟的潛在作用機制

2.2.1 物理類有害因子 卵母細胞在生長成熟過程中對溫度極為敏感，熱應激會給卵母細胞成熟造成嚴重損傷。熱應激可降低成熟卵母細胞母源物質的儲備，同時破壞縫隙連接，下調熱休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）和線粒體DNA 編碼的相關基因表達，致使ATP含量降低，活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平增加，凋亡信號通路激活，此外，熱應激還會破壞紡錘體組裝，降低卵母細胞成熟。

包括手機輻射、紫外線、-射線在內的各種輻射也會干擾卵母細胞成熟。手機輻射會造成超氧化物歧化酶（）、谷胱甘肽過氧化物酶（）和過氧化氫酶（）的活性和總體抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，TAC）下降，脂質過氧化物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平升高，致使卵母細胞成熟降低。紫外線輻射也會使卵母細胞線粒體分布出現異常，拷貝數下降。此外，-射線會誘導線粒體膜電位丟失，抑制卵母細胞成熟。

2.22 化學類有害因子 化學類有害因子廣泛存在，如塑化劑、除草劑、除蟲劑、重金屬等均對卵母細胞成熟具有明顯毒性。

鄰苯二甲酸酯（Phthalic Acid Ester，PAE）是鄰苯二甲酸形成的酯的統稱，常被用作增塑劑。鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-（2-ethylhexyl）-phthalate，DEHP）及其代謝產物鄰苯二甲酸單乙基己基酯（Monoethylhexyl Phthalate，MEHP）已被證明會損傷卵母細胞成熟。DEHP 及MEHP 會破壞卵母細胞皮質顆粒、內質網和線粒體的定位，改變線粒體膜電位，紊亂氧化磷酸化基因表達，同時下調母源基因表達，損傷線粒體功能，降低ATP 含量，增加ROS 水平，破壞紡錘體組裝和染色體排列，造成DNA 損傷，觸發凋亡，以及改變表觀遺傳修飾（DNA 甲基化、H3K9me3 和H3K9ac），降低卵母細胞成熟。雙酚A（Bisphenol A，BPA）同樣作為增塑劑和內分泌干擾物，可降低卵母細胞成熟。BPA 可破壞線粒體、內質網和溶酶體的分布及功能，延遲減數分裂進程，提高ROS 水平，觸發自噬和凋亡，而且紊亂紡錘體組裝和染色體排列，改變表觀遺傳修飾（H3K4me2 和DNA 甲基化）水平，損傷卵母細胞成熟。

草甘膦（Glyphosate，GLY）是一種廣泛使用的有機磷類除草劑，嚴重危害動物生殖健康。研究表明，GLY 會抑制卵母細胞GVBD 發生，下調和基因表達，破壞線粒體分布和膜電位，提高ROS水平，破壞紡錘體結構，造成DNA 損傷和凋亡，降低卵母細胞成熟，另外，GLY 也會影響卵母細胞類固醇類物質生成，破壞卵母細胞成熟。

鎘（Cd）和鉛（Pb）等重金屬也會給卵母細胞帶來損傷。鎘暴露會紊亂卵母細胞細胞周期蛋白（）表達和成熟促進因子（）活性，提高ROS 水平，引發DNA 損傷和凋亡，而且破壞紡錘體組裝和染色體排列，造成染色體非整倍體，同時下調DNA 甲基化、組蛋白H3K9me3 和H3K9ac 水平，損傷卵母細胞成熟。鉛也具有生殖毒性，鉛可破壞線粒體分布，降低和酶活性，上調ROS 和MDA 水平，同時下調谷胱甘肽（Glutathione，GSH）水平，并通過信號通路干擾卵母細胞成熟。

2.2.3 生物類有害因子 霉菌毒素（Mycotoxin）是霉菌在其污染的食物中產生的有毒代謝物，常見的有赭曲霉素A（Ochratoxin A，OTA）、HT-2 毒素、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）等，嚴重危害動物生殖健康。其中，OTA 破壞線粒體功能，降低ATP 含量，提高ROS 水平，誘發凋亡，同時，紊亂紡錘體組裝和染色體排列，改變DNA 甲基化、DNA 羥甲基化、H3K9ac和H3K9me3 水平，破壞卵母細胞成熟。HT-2 提高卵母細胞ROS 水平，破壞紡錘體形態，誘導凋亡和自噬，同時，也會增加DNA 甲基化、H3K4me2 和H3K9me2水平，降低卵母細胞成熟質量。

動物感染的病毒也會破壞卵母細胞成熟質量。例如，牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）干擾類固醇類性激素合成，致使卵母細胞成熟質量下降。戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）也會促進卵母細胞凋亡。

3 外源有利因子對卵母細胞成熟的影響

3.1 外源有利因子與抗氧化 外源有利因子主要指可改善卵母細胞成熟質量的培養基添加物（表2）。目前的卵母細胞體外成熟培養體系是基于下丘腦-垂體-卵巢軸（Hypothalamic-Pituitary-Ovarian Axis，HPOA）激素調控基礎上，添加卵泡液（Follicular Fluid，FF）、表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）、半胱氨酸（Cysteine，CYS）等抗氧化因子建立。近年來，研究發現，外源有害因子主要是通過氧化應激損害卵母細胞成熟。為此，從外源因子中開發抗氧化劑，降低氧化損傷，成為提高卵母細胞成熟研究的熱點之一。目前，褪黑激素（Melatonin，MT）、天然酚類化合物、維生素、微量金屬元素等具有抗氧化功能的物質已被應用到卵母細胞體外成熟培養體系中，改善了卵母細胞成熟。

表2 外源抗氧化因子改善卵母細胞成熟的潛在調控作用

3.2 外源抗氧化因子調控卵母細胞成熟的潛在作用機制

3.2.1 褪黑激素調控卵母細胞成熟的作用機制 MT 是一種吲哚雜環類化合物，可調控HPOA 激素分泌，是目前最強的內源性自由基清除劑，呈現出強大的抗氧化功能。卵母細胞體外成熟過程中添加MT 可以改善線粒體分布和膜電位，提高GSH 含量，降低ROS 水平和凋亡，增強自噬，同時改善DNA 甲基化、DNA 羥甲基化、H3K9 整體乙?；?、H3K9 甲基化、H3K27 乙?；约癏4K16 乙?；缺碛^遺傳修飾，促進紡錘體組裝和染色體排列，提高卵母細胞成熟，還可降低內質網壓力促進卵母細胞成熟。此外，MT 能夠緩解外源有害因子對卵母細胞造成的損傷。例如，MT 可以保護卵母細胞免受熱應激導致的ROS 水平升高、GSH含量下降、凋亡以及紡錘體組裝紊亂，挽救DEHP及MEHP 導致的卵母細胞氧化損傷、凋亡、自噬以及紊亂的紡錘體組裝、DNA 甲基化和H3K4me2，還能降低BPA、GLY、OTA 等誘導的卵母細胞ROS 水平、凋亡、自噬以及紡錘體組裝和染色體排列紊亂，以及下調鎘誘導的內質網壓力，改善卵母細胞成熟?？梢?，MT 可以增強線粒體功能，減少氧化應激、內質網壓力及凋亡，調控自噬，改善紡錘體組裝、染色質排列以及表觀遺傳修飾，提高卵母細胞成熟。

3.2.2 天然酚類化合物調控卵母細胞成熟的作用 天然酚類化合物通常包括類黃酮化合物和非類黃酮化合物，均具有抗氧化活性。槲皮素（Quercetin，QUR）是一種具有多種生物活性的類黃銅酚類化合物，能夠有效清除自由基，可保護卵母細胞免受氧化損傷。研究發現，QUR 能夠改善線粒體活性，降低ROS 水平，抑制凋亡，改善卵母細胞成熟質量。在熱應激條件下，QUR 能減少顆粒細胞凋亡，維持卵母細胞成熟質量?？梢?，QUR 能夠有效改善線粒體功能，抑制凋亡，提高卵母細胞成熟質量。白藜蘆醇（Resveratrol，RES）是一種非類黃酮酚類化合物，同樣具有抗氧化功能。研究表明，RES 可改善S和基因表達，提高GSH 和ATP 含量，降低ROS 和凋亡水平，促進卵母細胞成熟。在熱應激條件下，RES 也能夠增強表達，提高GSH 含量，降低ROS 水平，增強卵母細胞成熟。RES 還能保護卵母細胞免受殺菌劑代森錳鋅誘導的凋亡?？梢?，RES 可改善線粒體功能，降低氧化損傷和凋亡，提高卵母細胞成熟質量?？傊?，天然酚類化合物具有抗氧化功能，改善卵母細胞成熟。

3.2.3 維生素對卵母細胞成熟的影響 維生素是一類必須從外界獲得維持機體正常生理功能所需的微量有機物質，包括維生素A、維生素B、維生素C 等，也具有很好的抗氧化活性。維生素C 能夠降低ROS 水平，改善表觀遺傳修飾相關基因表達，擦除DNA 甲基化和H3K27me3 以及建立H3K4me3 和H3K36me3，促進卵母細胞成熟，還能減輕BPA 對卵巢的毒性。此外，維生素B可提高卵母細胞GSH 含量，降低ROS 水平，改善凋亡相關基因表達?？梢?，維生素能夠有效防控氧化損傷，減少凋亡，改善表觀遺傳修飾，促進卵母細胞成熟。

3.2.4 微量元素對卵母細胞成熟的調控作用 微量元素（硒、鋅、銅等）在卵母細胞成熟中也發揮抗氧化作用。硒可提高卵母細胞谷胱甘肽過氧化物酶活力，降低顆粒細胞DNA 損傷。鋅能提高卵母細胞GSH 含量，降低ROS 水平，改善凋亡相關基因表達，還可抑制內質網壓力，增強卵母細胞成熟質量。

當然，還有眾多極有潛力的抗氧化物質可改善卵母細胞成熟。目前，尋找新的清除自由基的抗氧化物質，并開發健康有效的抗氧化成分是現代生殖健康研究領域的一個重要發展方向。同時，在卵母細胞體外成熟過程中，抗氧化物質的抗氧化機理、是否具有協同作用以及能否有效拮抗有害因子也需進一步研究。

4 小結與展望

卵母細胞成熟是一個復雜的動態調控過程，外源因子可直接或間接作用于卵母細胞，影響卵母細胞成熟，但外源因子如何作用于卵母細胞，調控哪些關鍵基因表達以及外源抗氧化因子如何拮抗有害因子發揮改善卵母細胞成熟作用目前還沒有明確答案。

最近幾年，單細胞多組學測序技術的興起和應用，可以更加精確地闡明外源因子在卵母細胞成熟過程中的作用。單細胞轉錄組和蛋白組測序能夠明確外源因子調控的卵母細胞成熟關鍵基因，表觀遺傳修飾組學測序可以從表觀遺傳修飾角度指出外源因子通過哪些修飾調控卵母細胞成熟關鍵基因表達，以及染色質可接近性測序更能精確反映外源因子對卵母細胞染色質開放性的調控，進而通過轉錄因子調控卵母細胞成熟關鍵基因表達。當然，卵母細胞成熟是一個精密的調控過程，其調控機理尚未完全闡明，外源因子在卵母細胞成熟過程中的作用也未充分揭示。為此，外源因子調控卵母細胞成熟機理已成為生命科學生殖領域的一個研究重點。相信，隨著卵母細胞研究新技術的發展和外源因子調控卵母細胞成熟機理的闡明，卵母細胞體外成熟培養體系將更加健全，卵母細胞成熟率和成熟質量將得到更大提高，更能有效促進胚胎工程技術在畜牧業中的廣泛應用。