心外膜與心臟修復再生

章瀾 黃從新

(武漢大學人民醫院心內科 武漢大學心血管病研究所 心血管病湖北重點實驗室，湖北 武漢 430060)

現如今缺血性損傷所致的心血管疾病仍是全球死亡的主要原因[1]。數百萬的心肌細胞因心肌梗死而丟失，再生醫學最重要的挑戰之一是設計如何替換心肌梗死后失去的數百萬心肌細胞，從而迅速觸發先天免疫反應以清除死亡或垂死的細胞，并且激活產生膠原的成肌纖維細胞以重塑細胞外環境[2]。在過去的20年里，研究人員已確定了幾種心臟修復的潛在策略，如誘導現有心肌細胞的增殖，通過注射干細胞進行細胞治療[3-5]。然而，由于成年哺乳動物的心肌細胞不會重新進入細胞周期來替代缺血組織，因此心肌的損傷是不可逆的[3]，目前還無針對人類心臟病的有臨床意義的再生療法。心外膜是位于心臟表面的一層由間皮細胞組成的膜，是一種多功能的心臟祖細胞組織，是心臟發育的信號中心，在心臟發育過程中起著重要的作用。在近期斑馬魚和小鼠的研究中表明，心臟損傷使心外膜及其衍生物復活，從而調節組織修復[6]。過去10年的研究表明，心外膜可能是心臟修復策略的關鍵靶點?，F總結心外膜與心臟修復和再生的相關機制，以及心外膜對心臟形成和發育的功能性貢獻，并提出未來的觀點，以突出新興的治療策略，旨在利用心外膜的再生潛力進行心臟修復。

1 心臟再生模型

受損心臟的功能再生預計包括清除壞死組織，恢復失去的肌肉，重建血管，以及消除新心肌細胞的電偶聯、炎癥和膠原蛋白、纖維蛋白的積累，其中主要的終點是產生新的、健康的心肌細胞[7-8]。雖然在成年哺乳動物心臟中有低水平心肌細胞增殖的報道，但表面上很少發生這種自然事件對心臟修復有意義的影響[9]。在2011年，Porrello等[10]研究的結果首次證明，新生小鼠在出生后的最初幾天，可在切除損傷后產生大量的再生反應，從而產生具有有限瘢痕的全尺寸心室。遺傳命運圖譜顯示，這種修復是由現有心肌細胞的增殖介導的。在低溫損傷模型中，將冷卻的探針應用于1日齡小鼠的心室表面，誘導局部細胞死亡，心臟在非跨壁損傷后再生，而在跨壁損傷后則不能再生[10]。這說明心臟的再生能力取決于受傷的嚴重程度。小鼠在7 d大的時候就失去了心臟再生能力，之后就會留下瘢痕。小鼠心臟再生能力與心肌細胞增殖之間的緊密聯系可能不僅僅是巧合[11-12]。此外，在出生早期，大多數小鼠心肌細胞是二倍體，過去兩年的研究表明，心肌細胞多倍體與心臟的損傷性再生能力有關[13]。與哺乳動物相反，低等脊椎動物例如斑馬魚和某些兩棲動物，成年后具有增強受傷心肌再生的能力。在這些較低的脊椎動物模型系統中，斑馬魚由于心肌替代的一致性和廣泛性以及該模型系統在分子遺傳學上的優勢，成為研究最為廣泛的模型系統[14]。

2 心外膜在心臟再生中的作用

2.1 心肌損傷后心外膜細胞起到激活心肌的作用

在過去的十年中，越來越多的研究通過動物模型系統來確定心外膜組織影響心臟修復的機制。低等脊椎動物如斑馬魚和某些有尾目兩棲動物，成年后擁有強大的心臟再生能力，其中斑馬魚由于其分子遺傳學的優勢而備受研究人員關注[14]。在正常情況下，成體心外膜處于相對靜默狀態。當心臟受到損傷時，心外膜對這種損傷具有快速而強烈的反應。心臟損傷后，心外膜細胞誘導標記胚胎心外膜，增殖并覆蓋損傷部位的基因表達，這一過程稱為激活。在斑馬魚中，實際上整個心外膜在受傷后的1～2 d內被激活，表達如抗衰蛋白，視黃醛脫氫酶(retinaldehyde dehydrogenase，RALDH)2，Tbx18蛋白和腎母細胞瘤1(Wilms tumor-1，Wt1)蛋白等蛋白[15]。在新生小鼠中，根尖切除與快速心外膜激活類似，都在整個器官范圍內誘導RALDH2和Wt1表達。在成年小鼠中，心臟損傷還引起胚胎心外膜標志物的重新表達[16]。

心臟損傷激活心外膜的分子機制(尤其是在器官范圍內)讓很多科學家非常感興趣，但對其仍知之甚少。有學者試圖通過評估標記小鼠胚胎心外膜的基因附近潛在的DNA調控元件的保守性來解決這個問題。研究人員通過與這些基因附近的增強子結合，確定了CCAAT/增強子結合蛋白轉錄因子家族是胚胎心臟和心肌梗死后成年心臟中RALDH2和Wt1表達的調節因子[17]。一項2017年的研究確定了轉錄激活因子BRG1(SWI/SNF染色質重塑復合體的催化亞基)在小鼠心臟發育過程中和心臟損傷后具有心外膜表達，是Wt1表達和心外膜激活的調節劑[18]。也有研究表明，心外膜激活會加劇炎癥反應。小鼠缺血再灌注損傷后，在心外膜表面、心外膜下腔和梗死區域可觀察到中性粒細胞。在成人心外膜中，CCAAT/增強子結合蛋白顯性陰性突變體的病毒表達減少了中性粒細胞的數量，表明CCAAT/增強子結合蛋白轉錄因子在中性粒細胞浸潤中具有調節功能。此外，心外膜與巨噬細胞的緊密連接表明與心外膜細胞活化有關。對心外膜細胞內在程序的研究和對激活外膜的外在因素的鑒定將有助于衍生生物學和潛在治療策略上的新發現[19]。

2.2 心肌損傷后心外膜細胞分化為心肌細胞參與心肌再生

早在對斑馬魚心尖切除再生機制研究中[19]，研究者發現心尖切除后會啟動心外膜細胞經過上皮-間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)向心內膜下遷徙分化為心肌細胞，參與心肌再生。2007年Smart等[20]發現使用胸脈肽β4預處理成年小鼠，能誘導心外膜細胞重新再表達Wt1，其用胸脈肽β4預處理的小鼠再構建心肌梗死模型，發現心肌梗死2 d后轉基因黃色熒光特異性標志的Wt1細胞(YFP+/Wt1+)位于成年小鼠心外膜上，并且可分化為Nkx2.5+和Isl1+心肌祖細胞，該研究首次指出，成年哺乳動物心肌損傷后心外膜能分化為心肌細胞參與再生，但其機制尚不明確。

盡管如此，對于心肌梗死后Wt1心外膜細胞是否能分化為心肌細胞目前尚有爭議。2011年Zhou等[21]在成年小鼠心肌梗死模型上研究發現，心肌梗死后Wt1心外膜細胞經過EMT后生成的心外膜衍生祖細胞(epicardium derived cells，EPDCs)僅存在心臟表面，僅能分化為成纖維細胞和血管平滑肌細胞，不能分化為心肌細胞。2012年Zhou等[22]建立wTIeR26R轉基因小鼠模型發現心肌梗死后Wt1心外膜細胞能分化為心肌細胞，但形狀為小圓，無成熟心肌細胞的結構，且數量少，于心肌梗死1～3個月出現在心肌梗死區，因此可排除Cre-loxP隨機重組或細胞融合的可能。由此可見成年哺乳動物心肌梗死后能激活Wt1在心外膜上再次表達并向間質細胞轉化，但與胚胎期不同在于產生的EPDCs缺乏遷徙能力，僅在心肌梗死區分化為少量的心肌細胞。Smart等[20]用能促細胞遷徙的細胞因子胸腺肽β4預處理誘導Wt1心外膜細胞參與再生，可能正是該細胞因子增強了Wt1心外膜細胞向心肌遷徒進而分化為心肌細胞的能力。

3 心外膜與心臟再生和修復的關聯

3.1 心外膜源性細胞在心臟損傷反應中的作用

先前存在的心外膜源性心臟成纖維細胞是肌纖維母細胞的主要來源，肌纖維母細胞通過分泌細胞外基質在壓力過載或缺血重塑時產生瘢痕組織。心外膜衍生的周細胞或內皮細胞也被報道表現出間充質細胞特性，并產生細胞外基質以響應損傷。成人心外膜被重新激活和擴張，以響應心臟損傷。一小部分EPDCs經歷EMT，成為分泌細胞外基質的肌纖維。在有限的情況下，EPDCs還可成為脂肪細胞。激活的心外膜還促進炎癥細胞(中性粒細胞或自然殺傷細胞、T調節細胞或調節性T細胞、巨噬細胞)的募集，并通過趨化因子的分泌穩定冠狀血管。心外膜也可促進心肌細胞的存活和/或細胞生長[23]。

3.2 心外膜再激活

心肌損傷后胎兒心外膜基因的激活被認為是一種保守的心臟修復機制。Wt1、Tbx18、RALDH1和RALDH2轉錄產物在小鼠心肌梗死后1 d和5 d內上調，尤其是在瓣膜和心房周圍，在損傷后2～4周表達減弱[24]。在成年小鼠和犬模型中都有記載，胎兒心外膜基因誘導與增殖增加和明顯的心外膜增厚相關[25]。與胎兒心外膜不同，成人心外膜會經歷EMT并產生心臟成纖維細胞和血管壁細胞，譜系追蹤實驗表明，心外膜對新生成纖維細胞或側支形成的貢獻最小。相比之下，認為成人心外膜更可用作再生潛能有限的旁分泌信號的來源[26]。因此，一個新興的研究領域包括開發利用心外膜源性發展計劃(EpCar撥號衍生的開發程序)來促進成年心臟的修復和再生的方法正在誕生[10]。

3.3 心外膜調節炎癥

急性炎癥是一種清除死亡細胞組織的代償性反應，然而，慢性炎癥可增加細胞死亡、纖維化形成和心功能不全障礙。最近的報告表明，細胞和旁分泌的炎癥過程，部分由重新激活的心外膜協調[27]。在健康心外膜中可觀察到具有修復特性的常駐心臟巨噬細胞(M2巨噬細胞)，但在衰老相關心臟功能障礙模型中其明顯耗盡[28]。Wt1b是一種早期的心外膜反應基因，與斑馬魚中的再生巨噬細胞的表達重疊，提示了在心臟發育過程中心臟巨噬細胞募集時心外膜的需求。Hippo信號通路下游作用因子Yes相關蛋白/含PDZ結合基序的轉錄共激活因子在心肌梗死后加重心臟炎癥，這是由于免疫抑制調節性T細胞的有限募集和來自成年小鼠心外膜的炎性細胞因子γ干擾素的分泌減少所致。在小鼠缺血再灌注損傷后腺病毒介導的CCAAT/增強蛋白結合蛋白增強Wt1和RALDH2的激活，推測其是通過減少急性中性粒細胞浸潤來減弱心臟損傷和纖維化[29]。

3.4 心外膜在心臟再生中的應用

心外膜不僅可通過分化為成纖維細胞、血管壁細胞和內皮細胞等以促進心臟再生，而且可通過分泌成纖維細胞生長因子等有絲分裂原的混合物來促進心肌細胞的增殖和胚胎心臟的生長。心臟再生發生在斑馬魚和出生后早期哺乳動物心臟的許多刺激中，包括根尖切除術、新生兒心肌梗死、冷凍消融或靶向消融。心外膜通過領導雙核心外膜細胞的遷移而主動再生，創口閉合，并有助于血管周細胞(平滑肌和成纖維細胞)的形成。心外膜源性成纖維細胞已獲得肌成纖維細胞表型(肌成纖維細胞和細胞外基質)，這在瘢痕消退階段可能是可逆的。心外膜通過分泌有絲分裂原促進巨噬細胞募集、血管新生以及心肌細胞周期再入[30]。

目前，通過增強內源性心臟修復祖細胞的分離、擴增和移植源自骨髓和心臟的細胞已取得了有限的成功。來源于成年人右心耳組織的原代心外膜細胞在體外培養早期即自發經歷了EMT轉變并獲得成纖維細胞性質，用腺病毒載體將轉錄因子心肌蛋白、轉化生長因子-β1或骨形態發生蛋白質2導入EPDCs時，這些細胞可分化為平滑肌細胞[31]。人類誘導多能性干細胞技術的最新進展已證明了通過調節骨形態發生因子、Wnt/β-Catenin信號通路、成纖維細胞生長因子和視黃酸信號傳導途徑將多能細胞分化為心外膜細胞及其衍生物的可行性。將人胚胎干細胞源性心外膜細胞與心肌細胞共培養，可促進心臟組織收縮力和心肌細胞的成熟[32]。此外，將人胚胎干細胞源性心外膜細胞和心肌細胞共同移植到梗死大鼠心臟中，可增強移植效果，同時改善收縮功能，并增加了與心肌細胞單獨的血運重建，朝著治療實踐邁進了一大步[32]。各種心臟疾病模型以評估心外膜激活的最新進展表明，通過促進心外膜和內皮細胞或心肌細胞之間的相互作用，心臟再生得到增強[33-35]。心外膜人卵泡抑素樣蛋白1的丟失是一種對損傷的適應性反應，恢復其水平將是逆轉心肌梗死后心肌死亡和重構的有效方法[36]。故上游生長因子信號可用于增強體外心外膜細胞的擴增或用于臨床實踐的新型治療策略的產生。然而，若供體不是自體的受體，細胞移植會受到免疫排斥的阻礙[37]。目前，關于心外膜細胞異質性的重要問題仍存在，這可能會使利用心外膜進行心臟修復的策略復雜化。因此，需對心外膜的屬性進行全面的分析評估，包括心外膜細胞的來源與分型、心外膜應對不同損傷或環境的反應、心外膜與心肌細胞間的聯系、心臟再生中心外膜的變化以及不同種屬之間心外膜行為的異同等以加強對心外膜細胞對正常發育、先天性心臟病和心力衰竭貢獻的了解，為利用心外膜的再生潛力進行心臟修復提供新策略。隨著單細胞轉錄組學技術的發展，可能對這個問題提供思路。利用高通量單細胞RNA測序平臺(RNA-seq或scRNA-seq)對心外膜進行轉錄分析，可識別出對心臟損傷反應起作用的基因和通路。

4 展望

心臟病是人類健康的主要殺手之一，因而心肌再生和修復具有廣泛且重要的臨床應用價值。心外膜在心臟發育中的重要地位提示其作為潛在治療手段的優越性。本文討論了通過心外膜的細胞自主和非自主功能調節心臟生長和組織修復的基因程序，廣泛地分析描述了心外膜分泌的因素，包括轉錄因子和信號通路的研究，以及炎癥因子的調制，這可能會加強心外膜介導的心臟修復。此外，治療策略的發展，以成纖維細胞和脂肪細胞的分化為代價將EPDCs重新定向到增殖細胞類型的策略，可補充目前主要基于干細胞和誘導多能細胞遞送的再生醫學方法。