機械牽張促進干細胞衍生心肌樣細胞進一步成熟的研究進展

古興旺 周帆 穆軍升

(1.首都醫科大學，北京100069； 2.中國人民解放軍總醫院第三醫學中心超聲科，北京100039； 3.北京市安貞醫院心外科，北京100029)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)發生后，梗死的心肌將逐漸由纖維組織代替，并永久地造成心功能下降，而干細胞由于其多向分化潛能，在組織修復重生方面有著巨大的潛能。因此，將干細胞療法應用于MI來逆轉下降的心功能，是一條前景可觀的思路。早期嘗試直接心肌內和靜脈內注射干細胞等方式有一定療效[1-2]，但其弊端在于過低的干細胞生存率[3]和心肌組織處的低停留率[4]，所以借用心肌補片等心臟組織工程技術[5]，并結合一些方式促進其預先向心肌細胞分化，可在一定程度上應對這些問題。在這方面，一般選擇全能干細胞和多能干細胞，如胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)、骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)、誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)和脂肪干細胞(adipose stem cell，ASCs)等。而由于應用ESCs存在的倫理和免疫排斥問題[6-7]，研究方向已轉向以多能干細胞為主[8-10]，其中，ASCs分化為心肌細胞的潛能可能要高于BMMSCs[11]。既往已有多種方法可促進干細胞分化為有功能的心肌樣細胞，即干細胞衍生心肌樣細胞(stem cell-derived cardiomyocytes，SCCMs)，然而研究表明，此種心肌細胞主要為幼稚型，其在形態、結構和功能方面類似于原生心肌細胞發育的早期階段[12]，很難進一步應用于臨床治療MI等疾病。因此，如何提高其成熟度來達到臨床應用的要求便成了目前亟待解決的問題。在目前被探索的多種方法中，機械牽張作為心肌細胞受到的主要機械刺激之一，被認為在這方面具有較大的潛能，但以往尚無對機械牽張研究的單獨梳理，現從機械牽張的參數、機械牽張對SC-CMs成熟的影響和可能存在的信號轉導機制等方面對相關研究現狀進行綜述。

1 促進SC-MCs成熟的機械牽張參數

體內搏動的心臟不斷受到回心血流充盈心腔所致的前負荷和心臟射血時主要來自主動脈壓的后負荷，機械牽張主要通過模擬正常心肌細胞受到的前負荷來促進SC-CMs的進一步成熟。牽張的施加方式多種多樣，最主要的原理是將工程化組織兩端分別固定在機械臂上，由一端可移動的機械臂控制牽張的幅度和頻率，也有基于磁力和氣壓控制等的牽張力施加設備[13-14]，由于種類和型號繁多且均能按設定的參數施加牽張力，也無不同設備間區別的相關研究，現不展開討論。牽張刺激的參數可分為牽張軸向、牽張幅度(以細胞被拉長的比例計算)、牽張頻率和牽張時間等。在牽張軸向上，盡管在研究機械牽張促進干細胞分化為SC-CMs時還有雙軸、多軸和等軸等多種方式[15-17]，但在促進SC-CMs進一步成熟時，單軸牽張仍是更主流的選擇[14，18-19]，且少有研究去探索軸向區別所造成的影響。牽張幅度方面，雖然Gir?o-Silva等[16]發現12%拉伸度未能誘導人ASCs中心血管標志物的表達，間充質細胞表面標志物(CD29和CD90)也保持不變，但他們說明以前有實驗證明10%甚至以上的牽張幅度可促進ASCs向心肌分化；其他眾多學者的研究表明，10%左右的牽拉程度可促進SC-CMs在心肌標志物和肌節發育等方面的成熟[13，15，17，20-21]，Huang等[22]通過對照實驗發現10%可能為最佳的牽張幅度，這可能與其接近生理狀態有關。在牽張頻率方面，Zhang等[21]和Ruan等[23]通過靜態(0 Hz)和循環(非0 Hz)牽張的對照實驗，肯定了后者的效果。為模擬正常的心臟搏動，循環牽張的頻率基本被選定為1 Hz，Huang等[22]進一步指出1 Hz或1.5 Hz的循環牽張可誘導干細胞表達心肌細胞相關基因，且1 Hz可能最為合適。另外，Morgan等[24]發現相比固定的頻率(1 Hz)，動態變化的牽張頻率對新生小鼠心肌細胞的細胞間偶連有所影響，但收縮功能在兩組間無明顯區別。牽張時間在大多數實驗中為1～7 d，也有學者將其細分至每天有固定的拉伸時間(如0.5 h/d)[19，25]，但和牽張軸向一樣，其和施加全天候牽張力的區別并未被研究。綜上所述，一組參數為10%、1 Hz和1～7 d(全天候)的單軸機械牽張可被視作較為通用的選擇。

2 機械牽張對SC-CMs成熟的影響

現今，研究者們已探尋出許多可促進SC-CMs分化成熟的策略，如長程培養、共培養、3D培養和電學刺激等，機械刺激也是其中重要的一員，主要包括流體剪切力和機械牽張等[26]。機械牽張(模擬前負荷)作為心臟組織接受的主要機械刺激之一，已被多個研究證明可有效促進SC-CMs的發育和成熟。以下將從結構和功能兩個層面探討機械牽張的影響。

2.1 結構層面

大量研究表明，牽張刺激可從細胞排列、細胞形態和肌節發育等方面誘導SC-MCs的分化成熟。Ruan等[8]的實驗表明，經過2周的靜態牽張培養，組織中的細胞相比無刺激組均表現出更高的有序性，基質膠原纖維的排列也更加規則；Tulloch等[27]則深入地以對準值為指標，定量分析循環牽張對誘導多能干細胞衍生心肌細胞(iPSC-CMs)和胚胎干細胞衍生心肌細胞(ESC-CMs)組織中細胞排列的影響，與無張力組相比，持續的靜態牽張培養和按一定頻率施加張力的循環牽張培養都成倍增加細胞排列的有序性。有趣的是，機械牽張能引起人ESC-CMs和人心房成纖維細胞在垂直于牽張方向上重新排列[28-29]，而另有實驗發現對于新生小鼠心肌細胞，其作用結果卻是平行[30]。此外，在Abilez等[10]的長程培養中，施加牽張的人iPSC-CMs在培養至25～28 d時表現出異質的細胞表型，其中心室肌樣細胞占比超過50%。對于肌節的發育，多數研究結果表明牽張刺激可促進工程組織中細胞的成熟，如更長的長度，更清晰整齊的橫紋等[31-34]；Kroll等[9]設計了一種能對培養在聚二甲基硅氧烷薄膜上的單層人iPSC-CMs同時施加電學和機械刺激的設備，施加機械牽張的組別中肌節長度卻明顯縮短，推測這也許和其二維培養環境或施加牽張力前的其他環節有關。

微觀表現上，機械牽張可有效促進SC-CMs心肌標志物的表達(包括RNA和蛋白質含量)。在眾多實驗[11，20，27，30，32，35-36]中，肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T、α-肌動蛋白、N-鈣黏蛋白、連接蛋白43、轉錄因子GATA4、轉錄因子Nkx2.5、心房鈉尿肽和腦鈉肽等重要心肌標志物均可被牽張刺激誘導表達，這些蛋白質對干細胞的形態、結構和功能發育具有重要作用；另外一個指標是β-肌球蛋白重鏈/α-肌球蛋白重鏈(β-MHC/α-MHC)的比值，其值的升高與心肌細胞的成熟相關[37]，在相應的研究中，α-MHC的含量不一定會下降，但β-MHC的表達量一般會被上調，且可高達800%[23，32]。

2.2 功能層面

在評價體外心肌細胞的功能時，收縮能力和收縮頻率是主要指標，在許多實驗中，細胞對心血管藥物的反應性和鈣流動力學表現也是重要的指標。研究表明，機械牽張能顯著提升心肌樣組織的主動收縮力[21]，其收縮力-前負荷關系也在合適的牽拉范圍內符合Frank-Starling定律，且循環牽張相比靜態牽張對曲線斜率的提升更加顯著[23]，但機械牽張對細胞自主收縮頻率的影響尚無定論[10，32]。對于一些藥物如異丙腎上腺素和利多卡因，給予牽張培養的細胞能對其作出類似原生心肌細胞的反應，表現為收縮力相應的增強[38-39]。這些提升可能得益于胞內肌節的發育以及組織的整齊排列等[30]。在鈣流動力學方面[9-10，23，32]，較為一致的觀念是牽張刺激可明顯提升鈣瞬變峰值，這也印證了其提升細胞收縮力的作用。另外，通過進一步測量組織的收縮力-頻率曲線(評價心肌興奮收縮偶聯的一個良好指標)，發現機械牽張有助于減弱細胞原本的負相關關系，向著正常心肌的正相關關系發展[8]。但在是否可縮短達峰時間、50%復極時間等問題上，目前仍有爭議。

對于MI的治療，培養心肌樣細胞的目的是保證其在植入受損心臟后能起到足夠的治療作用，達到盡可能恢復患者心功能的目的。從這個角度說，實驗室中評價SC-CMs是否心肌向分化成熟的最終方式應該是體內試驗，而目前相關的研究并不多。在Mihic等[32]的MI小鼠模型實驗中，雖然有無事先經受牽張刺激不會影響其心電圖表現，但2D超聲心動圖顯示牽張組的心室前壁厚度明顯增厚，對處死小鼠進行尸檢也可觀察到該組的工程組織與小鼠心臟擁有更好的嵌合度。Abd等[15]發現向兔MI區域注入干細胞并養育8周后，與未經過牽拉刺激的干細胞組相比，受牽拉組的左室射血分數和左室短軸縮短率均明顯改善，定量分析也顯示受牽拉組的MI面積明顯減小。這些實驗一定程度上說明對干細胞進行移植前牽張刺激對于恢復受損心臟結構和功能的積極影響，但仍需更多的研究證明其真實性和重要性。

3 信號轉導機制

如前所述，目前的研究大多停留在探究機械牽張的影響上，內在的信號轉導機制尚不明確，有如下兩條研究進展較大。(1)TRPV4/PI3K/Akt信號通路。TRPV4通道是允許Ca2+通過的非選擇性陽離子通道，其活動導致胞內Ca2+升高，研究證明，單軸循環牽張能激活TRPV4通道引起Ca2+內流，并激活經典的調控多種細胞生命活動的PI3K/Akt信號通路，最終導致人ESC-CMs在垂直于牽張方向上的重排[29]。類似的，也有研究者發現對于毛細血管內皮細胞，機械牽張可通過TRPV4通道促進其重排，進一步驗證了該通道的作用[40]。深入的實驗表明，激活TRPV4通道引起的Ca2+內流只占牽張刺激引起的一部分，也就是說在牽張刺激和Ca2+內流之間，還有其他機制起著作用，如TRPV2通道[29]。(2)(miR-27a)/SCF通路。miR-27a參與調控細胞的多態性、腫瘤發生、增殖和凋亡等病理生理過程。Cao等[17]發現，當BMMSCs被施加循環牽張刺激時，miR-27a的表達有所降低，而過表達它則會下調GATA4、TNNT2、MEF-2C和連接蛋白43等心臟標志物的表達，這意味著miR-27a在機械牽張的條件下抑制了BMMSCs的心肌向分化；同時，作者通過一系列步驟證明SCF基因是miR-27a的作用靶點，轉染SCF基因表達的siRNA可下調心肌標志物的表達，且同時轉染這些siRNA和miR-27則會進一步增加下調的幅度。這些結果綜合說明(miR-27a)/SCF通路在調控機械牽張對SC-CMs分化成熟的影響，但詳細的內容仍需更多的研究加以闡述。

4 問題和展望

綜上所述，機械牽張確實可在細胞形態、結構和功能等方面促進SC-CMs的成熟。但這方面研究存在的一個問題是研究的多樣性，差異巨大的研究設計和設備使不同研究之間的可比性很差，相應的，在開發出能滿足大多數學者要求的通用牽張施加設備和細胞培養環境上仍需更多研究和努力。此外，大多數研究的對照組僅設置在了是否施加機械牽張以探究其對SC-CMs成熟的影響，卻缺乏這些細胞與原生心肌細胞的對比，因而無從得知這些衍生心肌細胞的實際分化成熟度，不利于其臨床應用。事實上，即便機械牽張能有效促進SC-CMs的成熟，這種程度也遠不及原生心肌細胞[27]，這也不難理解，成熟的心肌細胞是在復雜的生理環境下接受各種刺激并經過長時間的生長發育而來的，從理論上來說，單獨模擬生理條件的牽張刺激自然很難在幾天內讓SC-CMs接近前者的分化程度。因此，內在的信號轉導機制作為重要的啟發和推進動力就顯得格外重要，但目前也少被深入研究，且體內試驗也屈指可數，更不用說進一步應用于臨床。種種跡象均表明這方面的研究尚未成熟。結合目前的研究狀況，未來研究需重點突破低促成熟效率和低分子機制認知程度，在充分認識內在信號轉導機制的基礎上，聯合應用不同的策略，也許有助于盡早達到理想的效果。