桔梗多糖對S180荷瘤小鼠腫瘤生長及免疫功能的影響

王菊，梁蕾

(1. 長春醫學高等?？茖W校 基礎護理教研室，長春 130031；2. 長春市傳染病醫院 藥劑科，長春 130123)

桔梗始載于《神農本草經》，為藥食同源類中藥，具有抑炎、鎮咳、祛痰等藥理作用，三萜皂苷類、甾醇類、酚類、黃酮類及多糖類是其主要功效成分[1]。近年來，桔梗多糖的生物活性逐漸引起了人們的注意，它具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、保肝及抗感染等作用[2]。研究發現，桔梗多糖可顯著抑制HeLa細胞增殖[3]，也可通過調節細胞凋亡相關基因的表達促進腫瘤細胞的凋亡而發揮抑制小鼠子宮頸癌細胞U14生長的作用[4]。但桔梗多糖對S180惡性肉瘤細胞的作用未見報道，同時，鑒于免疫功能調節是中藥抗腫瘤的重要機制[5]，本研究以S180荷瘤小鼠模型為研究對象，在進一步探討桔梗多糖是否具有抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長作用的過程中重點關注其對機體免疫功能的影響，以期為桔梗多糖的臨床應用奠定一定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象S180瘤株及小鼠淋巴瘤YAC-1細胞，購自上海歌凡生物科技有限公司。C57BL/6小鼠，55只，SPF級，雄性，體質量(20±2) g，6～8周齡，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司。

1.2 藥物與試劑桔梗多糖粉末，購自上海融禾醫藥科技發展有限公司，多糖含量>80.0%；環磷酰胺注射液，購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；FBS及RPMI 1640培養液，購自HyClone公司；刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)及MTT溶液，購自Sigma-Aldrich公司；EZ-SepTMMouse 1×淋巴細胞分離液，購自南京建成生物工程研究所；小鼠血清IL-2及IFN-γ檢測試劑盒，購自北京達科為生物技術有限公司；兔抗小鼠TLR4、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)及NF-κB多克隆抗體，購自CST公司；兔抗小鼠GAPDH多克隆抗體及山羊抗兔IgG-HRP二抗，購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 實驗儀器BHC-1300ⅡA2生物安全柜，來自上海鼎科科學儀器有限公司；BPH-9042精密恒溫培養箱，來自上海一恒科學儀器有限公司；JA5103N電子天平，來自上海力辰儀器科技有限公司；Varioskan LUX多功能酶標儀，來自Thermo Fisher Scientific公司；Mini-PROTEAN Tetra電泳槽，來自伯樂公司。

1.4 小鼠S180腫瘤模型的建立用無菌生理鹽水稀釋培養至對數生長期的S180細胞至2×106個/mL密度，制備S180細胞懸液。隨機取5只健康C57BL/6小鼠，分別腹腔注射0.4 mL上述細胞懸液。1周后，可見小鼠腹部明顯凸起、漲大，頸椎脫臼處死小鼠，并在無菌條件下抽取腹水。于顯微鏡下計數腹水細胞，無菌生理鹽水調整細胞密度至1×106個/mL，另隨機取40只健康小鼠,分別于右腋皮下處注射上述腹水懸液0.2 mL，制備S180荷瘤小鼠模型。

1.5 分組、給藥及抑瘤率、胸腺指數、脾臟指數的測定將荷癌小鼠隨機分為模型對照組、環磷酰胺(0.02 g/kg)組及桔梗多糖低(0.2 g/kg)、高(0.4 g/kg)劑量組，每組10只；另取10只健康小鼠作為空白對照組。桔梗多糖的給藥劑量參考陸文總等[4]的研究并結合預實驗結果確定。環磷酰胺組腹腔注射給藥，桔梗多糖低、高劑量組灌胃給藥，1次/d，連續治療14 d。末次給藥后24 h，取小鼠球后靜脈叢血液，離心、分離血清；頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下剝離瘤塊，電子天平稱重；摘取小鼠的胸腺及脾臟，稱重后計算抑瘤率、胸腺指數及脾臟指數。

抑瘤率=(模型對照組瘤質量-藥物處理組瘤質量)/模型對照組瘤質量×100%

胸腺(脾臟)指數=胸腺(脾臟)質量/體質量×100%

1.6 H-E染色觀察瘤組織病理形態用4%多聚甲醛固定新鮮腫瘤組織樣本，經75%乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋等步驟后，將組織塊切成4 μm厚度的薄片；分別用蘇木精及伊紅染色處理，經中性樹脂封片后于光學顯微鏡下觀察并攝片。

1.7 淋巴細胞增殖刺激指數的測定參考文獻[6]處死小鼠后，無菌條件下剖取脾臟，PBS漂洗2次；將脾臟置于RPMI 1640培養液中，用注射器拉桿柄輕輕研磨，經200目濾網過濾。收集濾液于1.5 mL無菌離心管中，1 700×g離心5 min；將沉淀溶于Tris-NH4Cl溶液中，用紅細胞裂解液去除紅細胞；1 700×g離心5 min收集沉淀；將沉淀溶于RPMI 1640完全培養液中。臺盼藍染色計數淋巴細胞，調整脾臟淋巴細胞懸液至密度為5×106個/mL。于96孔細胞培養板中先分別加入100 μL脾臟淋巴細胞懸液，再分別加入100 μL ConA(10 μg/mL)，于5% CO2、37 ℃條件下培養48 h， 此為實驗組； 陰性對照組不加ConA， 其余操作同實驗組。參考文獻[7]，通過MTT法檢測各孔光密度[D(570 nm)]值，計算淋巴細胞增殖刺激指數(公式如下)。

淋巴細胞增殖刺激指數=實驗組D(570 nm)值/對照組D(570 nm)值

1.8 NK細胞活度的測定調整處于對數生長期的YAC-1細胞(靶細胞)密度至1×105個/mL；調整制備的脾臟淋巴細胞(效應細胞，含NK細胞)密度至2×106個/mL。各取100 μL效應細胞、靶細胞懸液至96孔細胞培養板，于5% CO2、37 ℃條件下培養72 h，此為實驗組； 另設靶細胞組(培養液和靶細胞懸液各100 μL)和效應細胞組(培養液和效應細胞懸液各100 μL)，其余操作同實驗組。MTT法檢測各孔D(570 nm)值，計算NK細胞活度(公式如下)。

NK細胞活度={1-[實驗組D(570 nm)值/靶細胞組D(570 nm)值-效應細胞組D(570 nm)值/靶細胞組D(570 nm)值]}×100%

1.9 小鼠血清細胞因子水平的測定ELISA檢測各組小鼠血清IL-2及IFN-γ水平，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.10 小鼠瘤組織炎癥相關蛋白表達水平的測定于冰水浴條件下的研缽中研磨腫瘤組織，加入組織裂解液充分裂解，制備總蛋白提取液。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法測定總蛋白含量，煮沸變性后加入上樣緩沖液。進行12% SDS-PAGE及半干法轉膜，加入相應的兔抗小鼠TLR4(1∶2 000)、MyD88(1∶1 000)及NF-κB(1∶1 000)多克隆抗體，于4 ℃條件下孵育12 h。依次經TBST洗膜，山羊抗兔IgG-HRP孵育，顯影及曝光后，通過Quantity One軟件分析各目的條帶的灰度值。

2 結果

2.1 桔梗多糖抑制S180荷瘤小鼠腫瘤的生長與空白對照組比較，給藥7 d后，環磷酰胺組小鼠體質量顯著降低(P<0.05)；給藥14 d后，與空白對照組比較，環磷酰胺組及模型對照組小鼠體質量顯著降低(均P<0.05)；給藥7 d及14 d后，與空白對照組比較，桔梗多糖低、高劑量組小鼠體質量無顯著變化(均P>0.05)。與模型對照組比較，給藥7 d及14 d后，環磷酰胺組小鼠體質量降低，而桔梗多糖低、高劑量組小鼠體質量增加，但差異不顯著(均P>0.05)。與模型對照組比較，環磷酰胺組及桔梗多糖低、高劑量組小鼠瘤質量顯著減少(均P<0.05)，抑瘤率顯著增加(均P<0.05)。H-E染色結果可見，模型對照組小鼠腫瘤細胞排列緊密，核固縮、核碎裂少見；環磷酰胺組小鼠腫瘤細胞排列松散，大部分細胞呈現核固縮、核碎裂等改變；桔梗多糖低、高劑量組小鼠腫瘤細胞排列較緊密，部分細胞出現核固縮、核碎裂等改變。(圖1)

注：A. 各組小鼠體質量的變化曲線；B. 各組小鼠腫瘤質量的統計分析結果；C. 各組小鼠腫瘤標本的比較； D. 各組荷瘤小鼠抑瘤率的統計分析結果；E. 各組荷瘤小鼠腫瘤組織的H-E染色結果(×200)。Ⅰ為空白對照組；Ⅱ為模型對照組；Ⅲ為環磷酰胺組；Ⅳ為桔梗多糖低劑量組；Ⅴ為桔梗多糖高劑量組。與空白對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05。圖1 桔梗多糖對各組小鼠及移植瘤一般情況的影響〗

2.2 桔梗多糖增加S180荷瘤小鼠胸腺指數及脾臟指數胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，本研究發現，與空白對照組比較，模型對照組、環磷酰胺組及桔梗多糖低、高劑量組小鼠的胸腺指數及脾臟指數均降低，差異有統計學意義(均P<0.05)；與模型對照組比較，環磷酰胺組小鼠胸腺指數及脾臟指數顯著降低(均P<0.05)，而桔梗多糖低、高劑量組小鼠相應指數顯著增加(均P<0.05)。以上結果提示，桔梗多糖對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用與其促進小鼠免疫功能有關。(表1)

表1 桔梗多糖對各組小鼠胸腺指數及脾臟指數的影響

2.3 桔梗多糖增加S180荷瘤小鼠淋巴細胞增殖刺激指數及NK細胞活度與空白對照組比較，模型對照組、環磷酰胺組小鼠淋巴細胞增殖刺激指數及NK細胞活度顯著降低(均P<0.05)，桔梗多糖低劑量組的NK細胞活度與之相比也顯著降低(P<0.05)。與模型對照組比較，環磷酰胺組小鼠淋巴細胞增殖刺激指數顯著降低(P<0.05)，而NK細胞活度變化無顯著差異(P>0.05)；與模型對照組比較，桔梗多糖低、高劑量組小鼠淋巴細胞增殖刺激指數及NK細胞活度顯著增加(均P<0.05)。以上結果進一步提示，桔梗多糖對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用與其促進機體免疫功能有關。(表2)

表2 桔梗多糖對各組小鼠淋巴細胞增殖刺激指數及NK細胞活度的影響

2.4 桔梗多糖增加S180荷瘤小鼠血清IL-2及IFN-γ水平與空白對照組比較，模型對照組、環磷酰胺組小鼠血清IL-2及IFN-γ水平顯著降低(均P<0.05)，桔梗多糖低、高劑量組小鼠IL-2水平變化無顯著差異(均P>0.05)，而IFN-γ水平顯著降低(均P<0.05)。與模型對照組比較，環磷酰胺組IL-2水平顯著降低(P<0.05)，IFN-γ水平顯著增加(P<0.05)；給予低、高劑量的桔梗多糖治療后，IL-2及IFN-γ水平顯著增加(均P<0.05)。上述結果表明，增加荷瘤小鼠血清細胞因子表達是桔梗多糖抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長的可能機制之一。(表3)

表3 桔梗多糖對各組小鼠血清IL-2及IFN-γ水平的影響

2.5 桔梗多糖下調TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的活性與模型對照組比較，環磷酰胺組及桔梗多糖低、高劑量組TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達量顯著降低(均P<0.05)。上述結果表明，桔梗多糖具有抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路活化的作用。(圖2、表4)

注：Ⅱ為模型對照組；Ⅲ為環磷酰胺組；Ⅳ為桔梗多糖低劑量組；Ⅴ為桔梗多糖高劑量組。圖2 桔梗多糖對各組小鼠瘤組織TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達的影響

表4 桔梗多糖對各組小鼠瘤組織TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達的量化影響

3 討論

機體免疫系統與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關。近年來，免疫類中藥多糖因其抗腫瘤活性顯著、毒副作用小且具有調節機體免疫功能等特點被廣泛應用于臨床[8]。胸腺是T細胞分化、發育、成熟的場所，對維持淋巴器官發育及機體免疫功能的正常發揮作用關鍵，胸腺若退化機體的免疫功能也會降低[9]。脾臟是機體體液免疫和細胞免疫的“生發”中心，為機體最大的外周淋巴組織器官，通過輸出巨噬細胞、淋巴細胞等調節免疫功能[10]。本研究發現，與模型對照組比較，桔梗多糖低、高劑量組小鼠胸腺指數及脾臟指數均明顯增加，提示桔梗多糖對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用與增加其免疫功能有關。此外，桔梗多糖低、高劑量組小鼠淋巴細胞增殖刺激指數及NK細胞活度均明顯增加，進一步提示桔梗多糖對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用與其免疫功能的增加有關。

細胞因子表達水平是衡量機體免疫功能的重要指標，可間接反映機體的免疫功能和腫瘤的進展情況[11]。IL-2由活化的T細胞產生，具有強大的抗腫瘤效應，為最強的免疫活性細胞調節因子，被認為是免疫系統產生抗腫瘤作用的首要因素[12]。IFN-γ由T細胞和NK細胞產生，是1種免疫調節劑，可增強NK細胞的活性，也可促進CTL殺傷腫瘤細胞的敏感性[13]。本研究結果發現，與模型對照組比較，桔梗多糖低、高劑量組小鼠IL-2及IFN-γ水平均明顯增加，表明增加荷瘤小鼠血清細胞因子的表達是其抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長的可能機制之一。

研究表明，TLR信號通路與許多中藥多糖的免疫調節作用有關，其中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在中藥多糖主導的抗腫瘤及免疫調節等過程中發揮關鍵作用[14-15]。MyD88是1種細胞內信號轉導銜接蛋白，含TLR的胞內結構域，TLR4可通過與MyD88結合促進NF-κB活化，誘導腫瘤的發生發展[16-17]。研究發現，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的活化，進而改善機體免疫功能是多種中藥成分發揮抗腫瘤作用的主要機制[18-19]。本研究結果同樣發現，與模型對照組比較，桔梗多糖低、高劑量組小鼠TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達均明顯降低，表明阻斷該信號通路的活化與其抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長關系密切。

綜上所述，本研究證實桔梗多糖具有抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長的作用，該作用與改善機體免疫功能有關，但具體的作用機制還有待于進一步研究。