思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道可培養細菌的多樣性

羅曼 熊忠平 熊智 李選文 李雕益 包書軍

摘要：采用純培養法對采集自云南地區的思茅松毛蟲（Dendrolimu kikuchii）3齡幼蟲進行腸道細菌多樣性的研究，這些研究資料與菌種數據為后研究思茅松毛蟲發育奠定基礎。對采自安寧市的150頭思茅松毛蟲3齡幼蟲的腸道細菌進行分離與純化，并且對所培養菌株的進行形態特征觀察及生理生化指標測定，通過這種方法對菌株進行初步的鑒定，再結合16S rDNA分子鑒定技術進行分析，判定細菌多樣性。結果顯示，從3齡幼蟲腸道中共分離到152株細菌，初步鑒定隸屬于6個屬9個類群，分別為62株芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）（3個類群）、35株微球菌屬（Micrococcus sp.）（2個類群）、23株葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）（1個類群）、11株鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）（1個類群）、12株不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）（1個類群）、9株泛菌屬（Pantoea sp.）（1個類群）。其中，芽孢桿菌屬具有最高的相對分離率為40.78%，為優勢菌群。思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道細菌的多樣性豐富，通過分析細菌種類及各水平之間的相關性，為更深入研究細菌與思茅松毛蟲的關系和為思茅松毛蟲的防治奠定基礎。

關鍵詞：思茅松毛蟲;腸道細菌;多樣性;16S rDNA;分離

中圖分類號： S182? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）21-0128-06

收稿日期：2021-03-16

基金項目：國家自然科學基金（編號：31660029）。

作者簡介：羅 曼（1997—），女，河南信陽人，碩士研究生，主要從事腸道微生物研究。E-mail：819683586@qq.com。

通信作者：熊忠平，高級實驗師，主要從事森林病蟲害研究。E-mail：76250630@qq.com。

思茅松毛蟲（Dendrolimu kikuchii）又名褚色松毛蟲，屬于鱗翅目（Lepidoptera）枯葉蛾科（Lasiocampidae）松毛蟲屬（Dendrolimus）[1]。其以松針為食，體形大，幼蟲齡期長，且取食量較大，是我國南方松樹的重要害蟲之一，主要分布在云南、廣西、四川、湖南等?。▍^）[2]。在云南滇中地區，思茅松毛蟲1年發生1～2代，幼蟲共7齡，其4齡幼蟲開始越冬，主要危害思茅松等針葉樹，且存在明顯的寄生?；訹2]。

昆蟲與微生物的關系十分復雜，微生物參與到昆蟲生活的很多方面，而腸道微生物與宿主共生，相互合作[3]。體內的共生微生物對昆蟲具有重要的生理功能，可通過消化代謝和營養與昆蟲建立共生關系[4-7]。因此，研究思茅松毛蟲與其腸道微生物之間的關系，可進一步研究共生菌種類與宿主的關系，最終篩選出培育防治思茅松毛蟲的有效方法[8-9]。

目前，國內外有關昆蟲腸道微生物多樣性的研究已經發展到一定階段。其中，劉小改通過高通測序技術研究稻縱卷葉螟幼蟲腸道細菌微生物的多樣性，發現稻縱卷葉螟幼蟲期腸道微生物的物種豐富度較高，而卵期微生物的多樣性較高[10]。陳金華等利用變性梯度凝膠電泳（DGGE）和限制性片段長度多態性（RFLP）方法研究桑粒肩天牛幼蟲腸道微生物多樣性，發現桑粒肩天牛腸道微生物在豐富度和頻度2個方面都顯示出復雜的多樣性[11]。而王嬌莉采用DGGE及高通量測序檢測核桃舉肢蛾和桃蛀螟幼蟲腸道細菌群落優勢類群及豐度，發現核桃舉肢蛾幼蟲腸道多樣性稍高于桃蛀螟幼蟲腸道多樣性，但差異不顯著[12]。除此之外，前人研究的昆蟲腸道微生物多樣性還有豆天蛾[13]、日本龜蠟蚧[14]、華山松大小蠹[15]等。

現階段針對腸道微生物的研究主要集中在白蟻[16-18]、蜜蜂[19-20]等與生活關聯更大的昆蟲中，而針對林業危害嚴重的昆蟲腸道研究則較少見。試驗采用純培養技術和形態學對3齡幼蟲腸道細菌進行初步的分離鑒定，再利用16S rDNA序列測定幼蟲腸道的細菌種類，鑒定出幼蟲腸道細菌的關鍵種群。在了解思茅松蟲幼蟲腸道細菌多樣性及群落組成的基礎上，弄清其中的關鍵共生菌種類，為進一步研究這些共生菌對宿主昆蟲的生理功能，調節關鍵性的共生菌控制思毛松毛蟲提供理論基礎[21]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗時間和地點

2018年10月至2019年5月在云南省安寧市草鋪鎮森林（24°31′～25°6′ N，102°8′～102°37′ E）進行試驗。

1.1.2 試驗材料的采集和處理

試驗材料選用思茅松毛蟲3齡幼蟲，根據試驗地點具體情況，在方圓2 km范圍內隨機挑選30個樣品點，每個樣品點采集6頭健康的3齡思茅松毛蟲幼蟲及樹枝并帶回實驗室飼養，為后續試驗做準備。具體操作時再選取150頭健康幼蟲進行試驗。

1.2 分離培養基與試劑、儀器

牛肉膏蛋白胨培養基（NA）：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水定容至 1 000 mL，pH值7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min[22]。

培養基及生理生化鑒定所用分析純、化學試劑，均購自西隴化工股份有限公司;Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司;PCR擴增體系試劑，購自碩擎生物科技有限公司。

1.3 腸道細菌的分離純化

選取150頭健康的3齡幼蟲，在恒溫22～24 ℃、恒濕80%～85%條件下，用無菌水喂養幼蟲，40 h 后待其排空體內食物殘渣后進行試驗[23]。將思茅松毛蟲幼蟲置于冰上3～5 min，待其昏迷;采用70%乙醇擦拭蟲體表面30 s，0.25%次氯酸鈉沖泡 1 min，無菌水沖洗3次;將體表消毒好的蟲子固定于無菌蠟盤上，在無菌環境下操作，使用滅菌后的細尖鉗將昆蟲腹部剖開，取出整個腸道，并立即用0.9%無菌NaCl溶液沖洗表面2次，然后將腸道取出后置于無菌離心管中，向離心管中加入1 mL PBS緩沖液研磨成勻漿，備用[22]。

將上述腸道勻漿吸取1 mL置于9 mL PBS緩沖液中，稀釋成10-1，按照10的倍數梯度稀釋，制成10-2、10-3、10-4、10-5的稀釋液，吸取每個濃度稀釋液100 μL分別涂布于NA培養基中，每個梯度涂3個平板，作為試驗組。取最后一次清洗的無菌水100 μL涂布于NA培養基上，作為空白對照。涂板均勻后將培養平板倒置于37 ℃培養箱中培養，3 d后觀察空白對照是否有菌落形成，若無菌落長出，則選擇單菌落數在30～300個的培養皿，根據涂有腸道內容物懸液培養皿上的單菌落的不同特征，挑取單菌落至新的NA培養基平板上，采用分區劃線法進行純化，直至菌株形態基本一致，得到純菌株。將得到的菌種保藏于NA斜面培養基中，4 ℃保存備用[22]。

1.4 3齡幼蟲腸道可培養菌株的形態觀察

將經分離純化得到的純菌株用平板劃線法接種于新的NA平板上，在37 ℃下培養24～48 h，待菌落長成后，參考文獻[23]對菌落進行染色，并在顯微鏡下觀察菌株的形態，依據文獻[24]對其特征進行描述鑒定。

1.5 3齡幼蟲腸道可培養菌株的生理生化鑒定

按照朱旭芬等的微生物生理生化鑒定方法[25-26]，對3齡幼蟲腸道細菌進行生理生化鑒定。

1.6 3齡幼蟲腸道細菌16S rDNA分子鑒定

1.6.1 腸道細菌基因組DNA提取及PCR擴增

將1 mL過夜培養的細菌菌液按照Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒提取3齡幼蟲腸道細菌基因組DNA。提取出的細菌基因組DNA用1.0% 瓊脂糖凝膠檢測，得到的片段符合細菌基因組DNA大小后，將檢測合格的DNA產物作為16S rDNA序列擴增模板。選擇的擴增引物為：正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和反向引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）[12]。PCR擴增體系為：25.0 μL的2×Taq PCR MasterMix;3.0 μL的模板DNA;10.0 μmol/L 正向引物27 F和反向引物1 492 R各1.0 μL;雙蒸水補充至50.0 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30 個循環;72 ℃終延伸5 min，-20 ℃保存。取4.0 μL PCR擴增后的產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，將檢測合格的PCR擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.6.2 3齡幼蟲腸道細菌系統發育樹構建

測得的序列通過DNA MAN 6.0軟件進行矯正及拼接，拼接完成后的16S rDNA序列在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/中與GenBank數據庫中的序列進行BLAST同源性比對，選出與菌株相似度最高的序列，運用軟件MEGA 7.0構建Neighbor-Joining系統發育樹，判定其分類學關系[22]。

多樣性指數[28]的計算公式如下：

Shannon指數：H′=∑ki=1 （piln pi）;

Simpson優勢度指：DJ=-∑ki=1p2i;

Margalef豐富度指數：Ma=（S-1）/lnN。

式中：S表示某個3齡幼蟲腸道細菌的種類數;N表示某個3齡幼蟲腸道細菌的總量;pi表示某種3齡幼蟲腸道細菌的相對分離率。

2 結果與分析

2.1 3齡幼蟲腸道細菌的分離結果

從150頭3齡幼蟲腸道中共分離得到152株細菌，根據菌落的形態特征共有9個類群，整理編號為N301～N309。對分離得到的9株細菌的菌落特征進行分析，由表1可知，9株菌株中多數菌株的革蘭氏染色結果呈陽性，僅有3株呈陰性。其菌株的形狀多樣化，有球狀、桿狀、橢圓狀等，其中球狀居多，而N305、N307、N308為橢圓狀，N306、N309為桿狀;顏色多樣化，有灰白色、黃色、紫色等，其中灰白色和黃色占大部分，只有N309顏色為灰白色;大部分菌株邊緣整齊，但N305、N307、N308邊緣不整齊，呈鋸齒狀;所有菌株都是不透明或者半透明的。

從思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道細菌的相對分離比率（表1）可知，152株3齡幼蟲腸道細菌中，思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道細菌的Shannon多樣性指數、Simpson優勢度指數為、Margalef豐富度指數分別為2.1 486、0.8 785、1.5 924，說明思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道細菌具有豐富的多樣性。而N305、N307和N308的菌群相對分離率為40.78%，是思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道細菌的優勢菌群。

2.2 3 齡幼蟲腸道細菌生理生化鑒定及多樣性分析

采用細菌生化試驗對9種細菌群落進行淀粉水解等18種反應，發現有明顯差異（表2）。

經過對生理生化指標的聚類分析可知，9個細菌類群可劃分為2個遺傳聚類組，N301自成一遺傳聚類組，其他8個細菌類群為一聚類組，其中N302、N307屬于一類，N309、N306分別各屬于一類，N303、N308、N304、N305屬于一類（圖1）。

結合細菌的形態特征（表1）、生理生化特征（表2）、生理生化聚類（圖1），查詢細菌鑒定手冊后，將分離到的9種細菌形態分析對比，初步鑒定結果：N305、N307、N308屬于芽孢桿菌屬的Bacillus sp.1、Bacillus sp.2、Bacillus sp.3，N301為葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.），N309為鏈霉菌屬（streptomyces sp.），N302、N304為微球菌屬（Micrococcus sp.1、Micrococcus sp.2），N303為不動桿菌屬（Acinetobacter sp.），N306為泛菌屬（Pantoea sp.）。其中N305、N307和N308的芽孢桿菌屬相對分離率為40.78%，是思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道細菌的優勢菌群。部分菌株因菌種形態過于相似，需進一步進行后續分子生物學鑒定。

2.3 3齡幼蟲腸道可培養細菌16S rDNA PCR擴增及16S rDNA分析結果

由圖2可知，安寧市3齡幼蟲分離純化的腸道細菌基因組DNA，檢測合格后，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過觀察凝膠成像后，PCR擴增條帶均在1 500 bp左右，條帶清晰。

將所獲9種細菌形態3齡幼蟲腸道細菌16S rDNA序列在NCBI中比對，分離到的3齡幼蟲腸道細菌與相應菌株的16S rDNA序列相似度在95%～100%之間。其中，N301、N302、N304、N306、N308序列相似度為99%; N303、 N305序列相似度為98%;N309序列相似度為97%;N307序列相似度為96%。這152株細菌隸屬于6個屬9個類群。

初步鑒定結果顯示，N301為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus capitis），N302為南極微球菌（Micrococcus antarcticus），N303為約翰遜不動桿菌（Acinetobacter johnsonii），N304為黃褐微球菌（M. luteus），N305為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），N306為成團泛菌（Pantoea agglomerans），N307為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），N308為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis），N309為淡紫色鏈霉菌（Streptomyces lividans）。

2.4 系統發育樹

將3齡幼蟲腸道細菌的16S rDNA序列進行系統發育進化分析，構建系統發育樹（圖3）。由圖3可知，思茅松毛蟲3齡幼蟲腸道可培養細菌歸屬于3個大類：第一大類為放線菌門，包括微球菌屬（Micrococcus sp.）、鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）;第二大類為變形菌門，包括不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）、泛菌屬（Pantoea sp.）;第三大類為厚壁菌門，包括芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）。

3 結論與討論

昆蟲腸道微生物與宿主互惠共生，相互依存[5]。本研究以思茅松毛蟲3齡幼蟲為材料，通過對腸道可培養細菌進行一系列的菌落觀察、生理生化試驗和16S rDNA同源性分析，共分離得到152 株腸道可培養細菌，經測定隸屬于6個屬9個類群。進一步對其多樣性做深入的分析，可知思茅松毛蟲腸道可培養細菌具有豐富的多樣性。

筆者所在課題組之前研究過3齡思茅松毛蟲腸道好氧細菌的多樣性，得到好氧細菌11株，經ARDRA聚類分析，在70%遺傳相似度水平上歸屬4個類群，說明3齡松毛蟲腸道內好氧細菌的多樣性水平偏低[27]。而采自安寧地區的3齡幼蟲分離得到152株腸道細菌，隸屬于6個屬、9個類群。2個試驗有相似的結果，說明3齡思茅蟲毛蟲腸道微生物多樣性確實偏低?？赡苁且驗樗济┧擅x的草食性生活習性建立了腸道特定的營養環境，腸道微生物也通過復雜的調控過程。

枯草芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬，可在動物腸道或環境中分泌消化酶、維生素或抗菌物質，形成具有一定穩定性的微生物群系，影響動物腸道的微生物平衡[29-30]。本試驗對3齡思茅松毛蟲腸道微生物的多樣性進行研究，發現枯草芽孢桿菌含量豐富。而解淀粉芽胞桿菌是一種與枯草芽胞桿菌親緣關系很近的革蘭陽性細菌，能生產纖溶酶等重要的專一性蛋白酶，因此推測解淀粉芽胞桿菌與思茅松毛蟲腸道纖維素的消化相關[31-32]，該特性在研究解淀粉芽孢桿菌與食纖維素類昆蟲消化的關系方面具有重要意義?？莶菅挎邨U菌和解淀粉芽胞桿菌都屬于芽孢桿菌屬，本研究中芽孢桿菌屬的相對分離率最高，為40.78%，是3齡幼蟲腸道細菌的優勢菌屬。經分析，芽孢桿菌屬對思茅松毛蟲生長發育都有很大影響，對研究芽孢桿菌屬其他菌種與微生物腸道多樣性的關系提供了研究基礎。

思茅松毛蟲是林業重要的害蟲，對其腸道微生物的研究，可以補充昆蟲腸道微生物資源庫，也為其他相近種昆蟲腸道微生物多樣性研究提供參考。并進一步分析得出影響昆蟲生長發育的腸道細菌種類，為思茅松毛蟲的生物防治提供依據。

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