9株芽孢桿菌對水稻種子萌發的影響及對稻瘟病的生防效果

衛甜 呂敏 朱錦磊 蘇建坤 劉懷阿

摘要：為探明筆者所在研究室前期從水稻不同生境中分離到的9株芽孢桿菌對水稻種子萌發、幼苗生長的影響，本研究以種子發芽率、幼苗建成（苗長、鮮質量）為指標，結果表明除了枯草芽孢桿菌BGW9，其余芽孢桿菌對提高種子發芽率差異不顯著;枯草芽孢桿菌BT16、高地芽孢桿菌BYW11、蠟質芽孢桿菌JGN15、地衣芽孢桿菌JJN9能顯著促進幼苗生長，而枯草芽孢桿菌BT6、蠟質芽孢桿菌JJN2、高地芽孢桿菌BYW11、枯草芽孢桿菌BGW9能顯著提高幼苗鮮質量。在離體葉片上接種稻瘟病病菌評價其抗病性，研究發現高地芽孢桿菌BJW25、高地芽孢桿菌BYW11、蠟質芽孢桿菌JJN2、枯草芽孢桿菌BGW9的防治效果可達92%以上。根據促進水稻幼苗生長及稻瘟病防治綜合測評，高地芽孢桿菌BYW11、枯草芽孢桿菌BGW9可作為防病促生菌進一步研究，為芽孢桿菌后續開發成生物肥料、生防菌劑提供理論基礎。

關鍵詞：芽孢桿菌;發芽率;稻瘟病;生防效果;水稻萌發

中圖分類號： S511.20201;S435.111.4+1? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）21-0134-04

收稿日期：2021-02-22

基金項目：江蘇里下河地區農業科學研究所專項基金[編號：SJ（17）103]。

作者簡介：衛 甜（1990—），女，山西運城人，碩士，助理研究員，主要從事植物病害的生物防治工作。E-mail：weitian900128 @163.com。

通信作者：劉懷阿，副研究員，主要從事植物病害的綠色防控工作。E-mail：13815824068@163.com。

全世界一半以上人口以水稻作為主糧，水稻是全球重要的糧食作物。種子質量的好壞直接影響水稻的產量與質量，進而影響國家糧食安全。種子萌發和幼苗建成是水稻個體發育的重要階段，較高的發芽率是培育壯秧的基礎[1]，種子帶有稻瘟病病菌（Pyricularia oryzae）是導致苗瘟發生的重要原因[2] 。稻瘟病是水稻上的一種重要病害，其流行年份一般造成水稻減產10%～20%，嚴重時減產 40%～50%，甚至顆粒無收[3-4]。幼苗建成對作物生長同樣起著關鍵性作用，稻瘟病病菌可抑制植物根系生長，減少植株地上、地下部分干物質積累量，從而制約農業生產。因此，尋找一種具有良好防治效果的新型生防菌并且能夠促進植株生長對水稻產業可持續發展具有重要意義。

芽孢桿菌是植物促生內生細菌中研究較多的一個屬，常見的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus cereus）、解淀粉芽孢桿菌、蠟質芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢桿菌等。研究發現，芽孢桿菌易于分離和純化，同時產生耐熱、抗逆性強的芽孢，且制劑穩定、抑菌能力強、施用方便、便于運輸，成為重要的植物促生防病微生物[5]。

本研究選用的9株芽孢桿菌是江蘇里下河地區農業科學研究所植物保護研究室從水稻病健株不同生境中分離篩選得到的。前期研究表明，這9株芽孢桿菌，其中4株枯草芽孢桿菌、2株高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）、2株蠟質芽孢桿菌、1株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），對稻瘟病病菌有明顯的拮抗作用。本研究作者以此為基礎，對不同芽孢桿菌處理下水稻種子的萌發及幼苗建成進行研究，進一步探索這些菌株對水稻種子萌發的影響，以期提高種子發芽率、培育壯苗，同時能很好地防治稻瘟病，為把其開發為生物肥料、生防菌劑等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試9株芽孢桿菌2018年在江蘇省揚州市廣陵區灣頭水稻試驗基地稻瘟病嚴重的田塊分離篩選得到，具體信息見表1;供試水稻品種為南粳5055; 供試稻瘟病病菌由江蘇里下河地區農業科學研究所分離保存。

1.2 生防芽孢桿菌發酵液及稻瘟病病菌懸浮液的制備

生防芽孢桿菌發酵液制備：芽孢桿菌保存于 -70 ℃ 冰箱中。使用前在LB固體培養基上劃線，于28 ℃培養箱中培養16～24 h;挑選單菌落轉接到LB液體培養液中28 ℃ 200 r/min培養16～18 h（至對數生長期）;將培養好的種子液以1%的接種量轉入滅菌的LB培養液中進行擴大培養，28 ℃ 200 r/min培養24 h;所得的菌液于4 ℃ 6 000 r/min離心10 min收集菌體，菌體用0.85% NaCl重懸至濃度為1×108～1×109? CFU/mL備用。

稻瘟病病菌懸浮液制備：使用滅菌的接種針將 4 ℃ 斜面保存的稻瘟病病菌轉接到PDA固體平板培養基上25 ℃培養5～7 d后，轉接到玉米稻稈粉固體培養基上讓其繼續生長至菌落長滿培養基;用滅菌水輕輕洗去菌絲后放置黑光燈下3 d誘導產孢;最后加入適量滅菌清水將平板培養基上的稻瘟病病菌分生孢子沖洗下來;收集沖洗液并用2層紗布過濾，通過顯微鏡觀察計數，調整菌液濃度為 10倍顯微鏡下每個視野有 20到60 個孢子備用。

1.3 生防芽孢桿菌對水稻種子發芽率及幼苗生長的影響

試驗參照何龍生等的方法[6]，略有改動。水稻種子經表面消毒后，置于各芽孢桿菌發酵液中浸泡 1 d，以清水浸泡處理為對照;將處理好的種子均勻放入滅菌的90 mm直徑的鋪好2層濾紙的培養皿中清水催芽，隨機數取100粒，4 次重復;種子發芽過程中，每天早晚補充蒸餾水，保持濾紙濕潤即可;將培養皿置于28 ℃、16 h光照/8 h黑暗的培養箱中培養，5 d后計測發芽種子數，計算發芽率及相對發芽率。培養至 15 d，記錄和測量所有種子苗長及鮮質量，苗長為用直尺測量從水稻幼苗莖的基部到最長葉尖的長度。

發芽率=發芽的種子數/供試的種子數×100%;

相對發芽率=菌劑處理發芽率/對照發芽率×100%。

1.4 生防芽孢桿菌對稻瘟病離體葉片法的生防評價

按照試驗“1.2”節的方法分別制備生防芽孢桿菌發酵液及稻瘟病病菌孢子懸浮液。選取健康水稻葉片，剪取5 cm長中間葉段，放入供試菌株發酵液中，于搖床中200 r/min振蕩浸泡1 h，陰性對照在無菌水中浸泡1 h;在9 cm培養皿底部鋪1張濾紙，再在濕潤的濾紙上放置滅菌牙簽，在牙簽上放置浸泡后的葉片，然后將其放在人工氣候箱中培養72 h;用滅菌牙簽輕刺葉段表面，不傷及葉段角質層，每個葉段刺傷5個點，用移液槍吸取10 μL稻瘟病病菌孢子懸浮液分別接種在刺傷的5個點上，每個處理15個葉段，重復3次;所有處理在人工氣候箱中培養5 d后調查接種點稻瘟病病斑數量和測量病斑面積，根據病斑擴展面積計算病情指數[7-8]。

1.5 數據處理

試驗數據采用 DPS和 Excel 2013進行統計分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 9株芽孢桿菌對水稻種子發芽率的影響

通常用發芽率反映種子的發芽能力，發芽率越高，增產潛力越大。由表2可以看出，枯草芽孢桿菌 BGW9處理對水稻種子發芽率具有顯著的促進作用，相對發芽率為105.45%。相對清水對照，其余芽孢桿菌處理對水稻種子發芽率均明顯提升，發芽率基本保持在92%～96%之間，但差異并不顯著（表2）。由此說明，這9株芽孢桿菌雖然對水稻發芽率具有一定的促進作用，但只有BGW9與CK有顯著差異性?？赡苡捎谠诜N子發芽后期，不同處理對種子發芽率差別不大，但是在幼苗期會產生一些生長激素促進植物生長。

2.2 9株芽孢桿菌對水稻幼苗生長的影響

由表3可知，9株芽孢桿菌處理后，水稻種子苗長除高地芽孢桿菌BJW25相較均有顯著提高，枯草芽孢桿菌BT16、高地芽孢桿菌BYW11、蠟質芽孢桿菌JGN15、地衣芽孢桿菌JJN9促進幼苗生長率可達18%以上， 而枯草芽孢桿菌BT16相對清水對照，苗長增長21.63%;芽孢桿菌處理后除地衣芽孢桿菌JJN9外，其余均顯著增加了水稻幼苗的鮮質量，增長幅度大約在9%～22%之間，增效較明顯的菌株分別是枯草芽孢桿菌BT6、蠟質芽孢桿菌JJN2、高地芽孢桿菌BYW11、枯草芽孢桿菌BGW9。

地衣芽孢桿菌JJN9雖然能顯著提高幼苗質量，但是促進其鮮質量效果并不顯著，可能是由于該芽孢桿菌使得水稻增長過快，導致徒長，水稻根系不發達，營養物質缺乏而引起增重效果不佳。高地芽孢桿菌BYW11既能顯著提高水稻幼苗株高，又能提升幼苗鮮質量，可作為生物肥料促進植株生長，這些有待進一步研究。

2.3 9株芽孢桿菌對稻瘟病的生防評價

采用離體葉片法檢測9株不同芽孢桿菌對稻瘟病病菌的抑菌作用，結果表明，所有處理接種5 d后，枯草芽孢桿菌BT6及BT16、蠟質芽孢桿菌JGN15發病率較高，分別為76.67%、85.33%及86.00%，葉片接種點出現病斑且顏色加深，其余菌株處理出現淡黃褐色病斑，抑菌效果在90%之上的有6株，抑菌效果最佳的分別是高地芽孢桿菌BJW25、BYW11，蠟質芽孢桿菌JGN15對稻瘟病的防治效果不佳，具體抑菌效果見表4。

3 結論與討論

發芽率是衡量種子質量的重要指標。研究發現，稻米產量不高的原因之一是生產實踐中發現種子發芽率雖然達標，但含雜菌多，因此提高種子發芽率、幼苗的生長及降低病害發生對水稻產量起著重要作用[9]。植物內生菌能以多種方式和途徑促進植物生長與抗病，如提高植物根際酶活性、調控基因表達以及使植物產生生長激素[10-12]。前人研究發現，鏈霉菌JD211浸提液能提高水稻種子的發芽率，效果比赤霉素處理的更佳，同時在促進植物生長及控制植物病害方面具有一定的潛能[13];陳嘉敏等研究發現，解淀粉芽孢桿菌D2WM對蔬菜種子萌發具有促進作用[14];李輝等研究發現，蠟狀芽孢桿菌 SY 處理后，水稻種子的發芽率顯著提高[15];“中合牌”生物菌肥對雜交稻種子發芽、幼苗生長有明顯的促進作用[16]。本研究對前期分離得到的9株芽孢桿菌進行水稻發芽率、苗生長促生研究發現，枯草芽孢桿菌BGW9能顯著提高種子發芽率，同時促進水稻幼苗生長，但其促生及誘導機制尚不明確，有待通過進一步研究證明，猜測可能是因為芽孢桿菌能抑制植物病原菌的活動，改善作物的營養狀況，從而促進作物的生長[17]。

目前，在水稻生產上用于稻瘟病生物防治的芽孢桿菌主要包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等。研究發現，來源于水稻葉片的貝萊斯芽孢桿菌 E69和枯草芽孢桿菌 E66具有防治稻瘟病等多種真菌病害的生防潛力，同時分離的解淀粉芽孢桿菌 S170對稻瘟病的溫室防治效果達 80.57%[8，18];官穎研究發現，特基拉芽孢桿菌GYLH-1防治稻瘟病具有顯著的效果[19]。本研究從水稻不同生境中分離的高地芽孢桿菌BJW25、高地芽孢桿菌BYW11、蠟質芽孢桿菌JJN2、枯草芽孢桿菌BGW9在離體葉片上有明顯的防治效果，進一步說明其在防治稻瘟病上具有一定潛能。

綜合分析，本研究不僅為芽孢桿菌防治稻瘟病奠定了基礎，同時還拓寬了芽孢桿菌的應用領域。下一步將對這些生防菌防病促生機制進行進一步研究。

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