魚腥草揮發油對膝關節骨性關節炎大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影響

秦 萍，李章春，劉 燕，謝洪書

(黔南民族醫學高等?？茖W校，貴州 都勻 558000)

膝關節骨性關節炎(KOA)是臨床骨科較為常見的一種非細菌性、非對稱性的慢性退行性疾病，主要特征為關節軟骨的退化和退變，臨床表現多為膝關節腫脹、疼痛、活動受限、功能障礙、畸形等[1]。研究顯示，KOA的全球發病率約為12%，我國患病率為5.4%～30.5%[2]。中老年是該疾病的高發群體，嚴重影響患者日常生活及生命質量。盡管KOA的具體發病機制還不十分明確，但相關研究認為，IL-1β、IL-6等炎癥因子在其早、中期的發生與發展過程中具有關鍵作用[3]?，F代醫學常用的抗炎鎮痛藥物主要是糖皮質激素、臭氧等藥物，然而由于此類藥物易對腸胃產生嚴重的不良反應，所以治療效果并不理想[4]。中醫藥具有價格低廉、副作用小、止痛快等特點，在KOA的早、中期治療過程中具有獨特優勢[5]。魚腥草揮發油是魚腥草的主要成分，具有抗炎、抗病毒等作用[6]，目前已進行多項疾病的基礎醫學研究，但有關KOA的相關研究未見報道。通過觀察魚腥草揮發油對KOA大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影響，進一步探討魚腥草揮發油的抗炎作用及機制，為臨床治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組與藥物

60只健康SD大鼠，雌雄各半，體重200～220 g，單位：長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號SCXK[湘]2019-0013。隨機分為假手術組(正常對照組)、模型組(KOA模型對照組)、陽性藥物組(陽性藥物對照組)、魚腥草揮發油高中低劑量組，每組10只，分籠飼養，適應性飼養3 d。鹽酸氨基葡萄糖片(國藥準字H20060647，江蘇正大清江制藥有限公司生產)。

1.1.2 試劑與儀器

IL-1β、IL-6和TNF-α檢測試劑(武漢純度生物科技有限公司生產)、注射用青霉素鈉(國藥準字H13020431，華北制藥股份有限公司生產)、全自動酶標儀(mindrady MR-96A)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備

依據文獻[7]，假手術組大鼠在切口皮膚打開關節腔后，僅進行生理鹽水沖洗，進行縫合，不破壞半月板、韌帶等組織。其余組大鼠采用改良Hulth法進行造模：將大鼠用乙醚麻醉，仰臥位固定在操作臺上，取右側膝關節進行模型制備，常規備皮和消毒，無菌條件下于髕骨旁內側行2 cm左右切口，逐層打開皮膚、筋膜，暴露關節腔，屈曲膝關節，依次剪斷前交叉和內側副韌帶，摘除內側半月板。術中保護好其他周圍組織，切勿傷及關節軟骨面。用生理鹽水對關節腔進行清洗2～3次，逐層進行縫合。術后每組大鼠進行肌肉注射青霉素，劑量40萬U/d，連續注射7 d。第8 d開始每天驅趕大鼠活動，2次/d，每次30 min左右，連續驅趕4周，4周后開始給藥治療。

1.2.2 藥物提取與給藥

依據文獻[8-9]方法進行魚腥草揮發油的提取。將100 g干魚腥草粉碎，以1∶10的比例將料液與入蒸餾水進行充分混合，常溫下在旋轉蒸發儀中浸泡10 h，70℃加熱回流10 h，停止加熱，收集揮發油。以吐溫-80為乳化劑，溶于生理鹽水，配制成0.5%吐溫-80的揮發油制備液，儲存備用。給藥方法[10]：陽性藥物組給予鹽酸氨基葡萄糖水溶液灌胃治療(劑量0.26 g/kg)；魚腥草揮發油高、中、低劑量組分別以100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg揮發油制備液進行灌胃治療；模型組和假手術組給予同陽性藥物組相同劑量的蒸餾水灌胃，連續給藥6 w，1次/d。

1.2.3 實驗取材

于末次給藥后的次日稱取大鼠質量，股動脈取血處死大鼠，經靜置、離心，取上清液備用。截取大鼠膝關節及滑膜組織置于4%的多聚甲醛固定，取腎臟、肝臟、脾臟等組織，計算臟器指數。

1.2.4 標本處理

取經多聚甲醛固定的大鼠膝關節組織，經常規組織脫水、包埋、脫蠟等處理，進行HE染色，光鏡下觀察組織病理學改變。

1.2.5 IL-1β、IL-6和TNF-α檢測

ELISA法檢測各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平，嚴格遵循說明書進行操作。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 不同組別大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較

與正常組比較，模型組和各藥物治療組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各藥物治療IL-1β、IL-6和TNF-α水平均有不同程度的降低，其中陽性藥物組和高劑量組炎癥因子水平降低最為明顯，兩組間IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較差異不具有統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同組別大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較

2.2 不同組別大鼠膝關節組織病理學觀察比較

組織病理學檢測結果顯示，正常組大鼠膝關節滑膜未見異常改變(圖1)；模型組大鼠膝關節滑膜組織內可見纖維組織明顯增生及大量炎癥細胞浸潤(圖2)；與模型組相比，各治療組大鼠膝關節滑膜組織炎癥病理學改變均有不同程度減輕，其中高劑量組間質輕度纖維化，慢性炎癥細胞浸潤現象明顯好轉，與陽性對照組病變緩解程度相近(圖3～6)。

圖1 正常組大鼠膝關節滑膜組織切片(HE×400)Fig.1 Tissue sections of synovium of knee joint in normal group(HE×400)

圖2 模型組大鼠膝關節滑膜組織切片(HE×400)Fig.2 Tissue sections of synovium of knee joint in model group(HE×400)

圖3 陽性藥物組大鼠膝關節滑膜組織切片(HE×400)Fig.3 Tissue sections of synovium of knee joint in positive medicine group(HE×400)

圖4 高劑量組大鼠膝關節滑膜組織切片(HE×400)Fig.4 Tissue sections of synovium of knee joint in high dosage group(HE×400)

圖5 中劑量組大鼠膝關節滑膜組織切片(HE×400)Fig.5 Tissue sections of synovium of knee joint in medium dosage group(HE×400)

圖6 低劑量組大鼠膝關節滑膜組織切片(HE×400)Fig.6 Tissue sections of synovium of knee joint in low dosage group(HE×400)

3 討論

KOA的病變通常是從膝關節軟骨退行性改變開始，此后逐漸累及滑膜、關節腔等組織結構。有關發病機制研究發現，細胞因子、遺傳學、自身免疫等因素在其發生與發展過程中具有重要作用。研究發現[11-12]，KOA病變的一個重要原因是軟骨細胞異常分化，引起TNF-α、IL-1β、IL-6等分解代謝因子分泌加劇，這些炎癥因子與滑膜、關節軟骨的破壞關系十分密切。顏春魯[7]等對KOA大鼠炎性因子表達研究發現，IL-1β、IL-6和TNF-α在KOA大鼠血清內為高表達；金劍飛等[13]對KOA大鼠NF-κB信號通路進行研究發現，通過抑制NF-κB通路能夠下調IL-1β、IL-6和TNF-α炎癥因子水平，對KOA大鼠炎癥起到緩解作用。在本研究中，與正常組比較，模型組和各藥物治療大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)，表明模型制備導致KOA大鼠炎癥因子水平升高，該研究結果與此前相關研究結果較為一致。6 w給藥治療結束后，與模型組比較，各藥物治療組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均不同程度降低，其中陽性藥物組和魚腥草揮發油高劑量組下降最為明顯，且兩組間比較差異不具有統計學意義(P>0.05)，表明魚腥草揮發油能夠對KOA大鼠炎癥因子發揮抑制作用。

魚腥草屬三白草科蕺菜屬植物蕺菜的全草或地上部分，性微寒、味辛，具有消癰排膿、清熱解毒、利尿除濕的功效。魚腥草揮發油是其主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、清除自由基等多種生物活性功能[14]。李少金等[8]通過對魚腥草揮發油對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用進行研究，結果發現，魚腥草揮發油能夠降低大鼠IL-6和TNF-α水平，對心肌缺血再灌注大鼠損傷發揮保護作用。黃定根等[15]通過魚腥草揮發油對去卵巢小鼠骨質疏松的預防作用進行研究，結果表明，魚腥草揮發油能夠通過降低小鼠血清IL-1β和TNF-α水平，對去卵巢小鼠骨質疏松發揮保護作用。在本研究中，與模型組比較，陽性藥物組和魚腥草揮發油高劑量KOA大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平下降最為明顯，病理觀察顯示，高劑量組間質輕度纖維化，慢性炎癥細胞浸潤現象明顯好轉，與陽性對照組病變緩解程度相近，表明魚腥草揮發油對KOA大鼠膝關節滑膜組織具有保護作用，且呈劑量依賴性。

綜上所述，研究認為魚腥草揮發油能夠緩解KOA大鼠的炎癥，其作用機制可能與抑制炎癥因子表達有關，因魚腥草揮發油的應用研究尚處探索階段，其確切作用機制還需進一步深入研究。