外泌體調控口腔鱗狀細胞癌發生發展

費 凡，王雨萌，韓 冰

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous carcinoma cancer，OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤[1]。OSCC患者由于缺乏對該疾病的認識以及患者自身經濟、心理等因素的影響，多數患者就診時已為晚期，超過50%的OSCC患者出現頸淋巴結轉移，這是導致OSCC患者預后不良的最常見因素之一[2-3]。未發生區域性淋巴結轉移的OSCC患者其五年生存率大約為80%；但當涉及頸淋巴結轉移時，五年生存率降至40%；而出現遠處轉移者生存率則低至20%[4]。因此，提高OSCC患者生存率及改善預后的關鍵在于疾病的早期診斷和治療。

外泌體(exosome)是由多種類型的細胞分泌的一種具有脂質雙層膜結構的細胞外囊泡，具有其源細胞的生物學特性，其內容物主要包括蛋白質、DNA片段、RNA、細胞因子等，外泌體參與許多重要的生理病理過程，包括重塑腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)、調節免疫細胞功能、促進腫瘤發生發展及轉移等多個方面。此外，腫瘤細胞衍生的外泌體內含的特異性成分使其在腫瘤生物標志物方面也有應用潛力。本文對外泌體在OSCC的發生發展、侵襲轉移及化療耐藥等方面的研究進展進行綜述。

1 外泌體概述

外泌體是被脂質雙層包裹的納米級細胞外囊泡，直徑范圍為40～100 nm，它們在吞噬內體后形成攜帶腔內囊泡的多囊泡體。外泌體可由不同類型的細胞釋放，例如腸上皮細胞、成纖維細胞、造血細胞、脂肪細胞，最重要的是腫瘤細胞。一經釋放后，外泌體可與靶細胞的質膜融合在一起，從而將內容物釋放到細胞質內或成為內體并遵循內吞途徑，在靶向細胞的基礎上，外泌體可通過巨胞飲作用、受體介導的內吞作用或吞噬作用穿過細胞質膜，從而進行細胞間的膜物質交換、細胞間通信、傳遞細胞信號、改變基因的表達以及調控靶細胞的整體功能[5]。研究證實，外泌體可以將蛋白質、DNA、mRNA以及非編碼RNA等生物活性分子在細胞間傳遞，在腫瘤的發生發展、侵襲、轉移及耐藥中發揮作用[6]。由于外泌體是由內體形成的，所以轉運膜受體、熱休克蛋白、磷脂酶、核酸、脂質以及源自起源細胞的蛋白質，這些特征使這些納米顆粒在腫瘤診斷時成為極好的生物標志物。此外，外泌體可以作為信號通路，直接改變腫瘤細胞的侵襲能力，并啟動上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，也可以改變周圍和遠處非腫瘤細胞的生理狀態，使腫瘤細胞得以傳播。循環腫瘤來源的外泌體可通過轉運促進侵襲轉移的蛋白質和miRNA來影響細胞信號傳導和腫瘤微環境[7]。

2 外泌體與OSCC的發生發展

機體細胞分泌的外泌體可以攜帶各種分子，其中一些成分具有致癌作用，例如腫瘤蛋白、致癌轉錄因子、致癌miRNAs等，這些分子進入受體細胞后能夠啟動腫瘤的發生。同時腫瘤細胞又能分泌大量的外泌體，這些外泌體通過自分泌或旁分泌方式轉運維持腫瘤生長所需的因子，介導腫瘤與周圍基質組織之間的溝通，促進血管生成和細胞增殖相關通路的活化以及轉移前生態位的形成，從而最終促進腫瘤的進展[8-10]。研究發現，OSCC細胞能夠通過自身外泌體的分泌和攝取促進腫瘤的進展，該過程受到肝素的調控。硫酸肝素蛋白聚糖(heparin sulfate proteoglycans,HSPGs)是腫瘤細胞來源外泌體的膜受體，而肝素是依賴于HSPGs共受體的細胞表面受體的競爭性抑制劑，在肝素的存在下，OSCC細胞對外泌體的攝取受到抑制，從而阻止腫瘤的進展[11]。Razzo[12]的研究證實，單次靜脈注射腫瘤來源的外泌體足以使攜帶OSCC癌前病變的小鼠腫瘤進展加速，同時減少免疫細胞向腫瘤的遷移。

2.1 外泌體參與腫瘤微環境形成

OSCC具有由多種腫瘤細胞和多種基質細胞(如成纖維細胞、內皮細胞、周細胞、免疫細胞等)組成的復雜微環境[13]。腫瘤細胞與腫瘤微環境組分之間的主要通信方式是通過分泌外泌體來實現的[14]。Jiang等[15]發現OSCC細胞能向鄰近的正常成纖維細胞分泌含有p-ERK1/2的外泌體，直接激活ERK1/2信號通路并下調小窩蛋白(caveolin-1, CAV1)的表達，上調正常成纖維細胞中MCT4/PDK1的表達。這種調節在體內和體外都有發生，正因為如此，成纖維細胞分泌更多的乳酸，OSCC細胞攝取它們產生的乳酸，從而激活腫瘤細胞和活化的成纖維細胞之間的MCT4/MCT1軸，最終為腫瘤細胞的生長和繁殖提供更多的能量。腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblast, CAF)是TME重要的組成部分，與OSCC的進展關系密切[16]。Chen等[17]將腫瘤干細胞來源的外泌體(cancer stem cell-derived extracellular vesicles, CSC-EVs)和人正常牙齦成纖維細胞(normal gingival fibroblasts, NGFs)共培養，發現NGFs表達了明顯高水平的CAF標志物，即α-平滑肌肌動蛋白和波形蛋白。此外，CSC-EVs轉化的NGFs向培養基中分泌了大量的TGF-β1。由此得出，CSC-EVs促進NGFs向CAF轉化，進一步研究觀察到與親代細胞相比，在與CAF共培養后，CAL27和SCC-15細胞生成腫瘤球的能力增強。Li等[18]研究發現OSCC中的CAF衍生外泌體中的miR-34a-5通過AKT/GSK-3β/β-catenin信號級聯通路促進OSCC細胞的增殖和轉移。

2.2 外泌體促進血管生成

腫瘤的生長離不開對氧和營養物質的吸收，細胞代謝廢物的清除，而這些過程主要依賴于血管的構建[19]。因此血管的生成過程是腫瘤進展和轉移擴散的基礎，許多腫瘤細胞分泌的外泌體通過向TME中的基質細胞傳遞功能性microRNA和蛋白質來促進腫瘤血管生成[20]。de Andrade等[21]通過聚合物沉淀法和功能測定證明OSCC細胞分泌的外泌體可顯著誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的遷移和血管生成。Wang等[22]在OSCC細胞系CAL27分泌的外泌體中檢測到miR-210-3p，并能夠將miR-210-3p轉移到HUVEC中，提高了HUVEC中miR-210-3p的表達水平，通過激活PI3K/AKT信號通路促進血管形成。Dickman等[23]研究顯示OSCC細胞分泌的miR-142-3p通過消除miRNA腫瘤抑制作用來促進腫瘤細胞生長，外泌體還通過將miR-142-3p釋放到微環境中來促進腫瘤血管生成。

3 外泌體與OSCC的侵襲轉移

3.1 外泌體誘導EMT

腫瘤細胞局部的侵襲及遠處的轉移都被認為與EMT有關[24]。腫瘤細胞周圍健康上皮細胞內化細胞外囊泡導致EMT，將正常細胞轉變為紡錘形細胞，促進腫瘤環境內細胞的遷移和侵襲[25]。CAF在腫瘤的惡性進展中發揮著重要的作用，包括促進EMT和上皮間充質轉化轉移[26]。Sun等[27]證明CAF來源的外泌體將miR-382-5p轉運至OSCC細胞，促進了腫瘤細胞的遷移和侵襲。Li等[28]發現，缺氧微環境刺激OSCC細胞產生富含miR-21的外泌體，這些富含miR-21的腫瘤細胞來源的外泌體可分布到常氧區域，進一步研究發現，miR-21的過表達顯著增加了波形蛋白和SNAIL的表達并下調了E-鈣粘著蛋白的表達，誘導EMT發生，最終促進了體外OSCC細胞遷移和侵襲，并在異種移植小鼠模型中誘導腫瘤生長和轉移。OSCC細胞中含有EGFR的外泌體能夠將正常上皮細胞以旁分泌方式轉化為間充質表型[29]。近期有研究者發現，一種新的長鏈非編碼RNA TIRY在CAF來源的外泌體中過表達時激活了Wnt/β-catenin信號通路，下調miR-14的表達，使EMT標志物表達增加，包括轉錄因子(SNAIL和FOXC2)和細胞骨架蛋白(α-SMA、β-catenin和FSP1)從而增強OSCC的侵襲和轉移[30]。

3.2 外泌體與免疫抑制

腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAM)促進腫瘤的進展和轉移，并與不良預后相關。TAM是腫瘤炎癥微環境的關鍵驅動因素，有助于腫瘤細胞的存活和侵襲，誘導血管生成和阻斷抗腫瘤免疫反應[31]。Cai等[32]通過OSCC細胞衍生的外泌體與巨噬細胞共培養實驗發現，來源于OSCC細胞的外泌體將miR-29a-3p傳遞到巨噬細胞，誘導巨噬細胞向與腫瘤形成相關的M2亞型極化，共培養的培養基促進SCC-9和CAL-27細胞的增殖和侵襲。進一步研究發現，外泌體包裹的miR-29a-3p介導巨噬細胞極化的機制是促進了巨噬細胞中細胞因子信號抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)和轉錄激活因子6(signal transduction and transcriptional activator 6，STAT6)信號通路的活化。M2型巨噬細胞產生白細胞介素-10和精氨酸酶-1等免疫抑制性細胞因子來阻斷抗腫瘤免疫，并在許多癌癥如胰腺癌和OSCC中表達高水平的程序性死亡配體1(programmed death ligand 1，PD-L1)，從而觸發T細胞的檢查點阻斷并對腫瘤細胞產生免疫抑制作用[33-35]。Pang等[36]研究發現，OSCC細胞分泌的外泌體將CMTM6轉運至巨噬細胞，并通過激活ERK1/2信號通路誘導M2樣巨噬細胞極化，促進OSCC的侵襲及轉移。有報道稱，OSCC的血漿外泌體通過下調NK細胞中NKG2D的表達而抑制免疫系統。在活動性疾病患者中，血漿外泌體通過增加CD8+T細胞的凋亡，抑制CD4+T細胞的增殖，促進Treg細胞的產生，更有效地建立免疫抑制微環境[37]。這些發現表明來自OSCC的外泌體可能通過抑制免疫細胞的抗腫瘤作用參與了OSCC的侵襲。

4 外泌體與OSCC的預后

由于OSCC早期檢測的困難，大多數患者在就診時已有頸部淋巴結或遠處轉移。早期發現及治療對于降低死亡率和改善預后至關重要，因此，對于OSCC診斷和預后的生物標志物的早期檢測需求很高。Rabinowits[38]對舌鱗狀細胞癌患者的良、惡性組織和血漿中microRNA的表達進行了比較分析，在總共359個miRNA中，有16個在成對腫瘤和良性組織中差異表達。研究者發現，OSCC患者的循環外泌體miR-21的水平與T分期及淋巴結轉移密切相關[28]。Wang等[39]發現層粘連蛋白-332在有淋巴結轉移的OSCC患者血漿外泌體中高表達。Luo等[40]的研究顯示循環外泌體circ_0000199的高表達與咀嚼檳榔、腫瘤大小、淋巴結轉移和TNM分期顯著相關，此外高水平外泌體circ_0000199患者的腫瘤復發率及死亡率均高于低水平外泌體circ_0000199患者。綜上所述，外泌體在OSCC的早期診斷方面具有極大的應用潛力，并且可能成為OSCC的生物標志物。

5 外泌體與OSCC化療耐藥

化學療法是OSCC常見的治療方法，為癌癥晚期患者帶來許多益處，包括腫瘤的縮小、遠處轉移的減少以及預后的改善[41]。許多研究表明外泌體在腫瘤耐藥性形成中發揮重要作用。順鉑是治療OSCC患者的一線化療藥物，但目前順鉑的耐藥仍然是影響其臨床療效及應用的主要障礙[42]。Kulkarni[43]通過體外實驗觀察到順鉑耐藥的OSCC細胞中miR-30a表達較順鉑敏感細胞下降，進一步研究發現外泌體介導的miR-30a在順鉑耐藥的OSCC細胞中通過Beclin1降低自噬反應，同時抑制Bcl2促進細胞凋亡，從而恢復OSCC細胞順鉑敏感性。Liu等[44]研究發現，源自順鉑耐藥OSCC細胞的外泌體可以將miR-21轉移至OSCC親代細胞，并通過靶向磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)以及程序性細胞死亡4(programmed cell death 4，PDCD4)增強了順鉑的化療耐藥性并降低了DNA損傷信號。Wang等[45]研究發現過表達鋅指蛋白反義鏈-1(zinc finger antisense 1，ZFAS1)可以抑制OSCC細胞對順鉑的敏感性，促進OSCC細胞生長，進一步從順鉑敏感和順鉑耐藥的OSCC患者血清中提取外泌體進行實時熒光定量多聚酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)，研究結果顯示順鉑耐藥OSCC患者的血清外泌體中ZFAS1上調。

6 總結與展望

外泌體參與了OSCC的發生發展、侵襲轉移、化療耐藥等多個方面，由于其內包含不同的成分，能夠反映來源細胞的某些特性，故可用作OSCC的潛在生物標志物。目前關于外泌體的檢測標準和分離方法尚未完全統一，外泌體的生物安全性也是有待解決的問題。這方面的進一步研究，如臨床研究或大型動物模型研究仍然需要證明外泌體在治療中的安全性，尤其是從腫瘤細胞中分泌的外泌體。盡管面臨著巨大的挑戰和困難，外泌體仍然在OSCC治療和早期診斷中富有巨大的潛力，需進一步更全面地研究外泌體調控OSCC發生發展的內在機制，以期為OSCC的治療提供機會。