秋水仙素對華北型密刺黃瓜的誘變效應

劉美妍 周國彥 李曉麗 銀珊珊 邢雨蒙 謝洋

摘? ? 要：為探討適宜華北型密刺黃瓜多倍體誘導技術體系，以黃瓜（2n=2x=14）種子期、萌動種子期和子葉期為試材進行不同濃度秋水仙素處理，通過形態學、細胞學、流式細胞術鑒定，成功獲得三倍體（3x）、四倍體（4x）和混倍體（2x+4x/8x+16x）植株，并對二倍體和四倍體黃瓜進行農藝性狀和營養品質分析。結果表明，0.4%秋水仙素處理黃瓜萌動種子4 h誘導四倍體的效果最佳，DNA誘變率為18%;0.2%秋水仙素處理黃瓜種子2 h誘導三倍體和混倍體效果最佳，DNA誘變率為15%;四倍體較二倍體節間變短，葉色油亮，葉面積、雌花器官增大，花粉粒呈四孔，染色體、DNA含量加倍，果形指數減小幅度達35.66%，可溶性糖含量和硬度增幅分別為91.74%和34.73%。研究結果為黃瓜多倍體種質創制奠定了技術基礎。

關鍵詞：黃瓜;秋水仙素;多倍體;流式細胞術;果實品質

中圖分類號：S635.1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）11-010-07

Mutagenesis effect of colchicine on north China cucumber with dense thorny

LIU Meiyan1， ZHOU Guoyan1， LI Xiaoli1，2， YIN Shanshan1， XING Yumeng1， XIE Yang1，2

（1. College of Horticulture Science and Technology， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066004， Hebei， China; 2. Hebei Key Laboratory of Horticultural Germplasm Excavation and Innovative Utilization， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066004， Hebei， China）

Abstract： In order to explore the technology suitable for the induction of autotetraploid of north China cucumber with dense thorny， the cucumber （2n=2x=14） was treated with colchicine at different concentrations at seed stage， germination stage and cotyledon stage. The triploid （3x）， tetraploid （4x） and miploid （2x +4x/ 8x+16x） plants were successfully obtained by morphological， cytological and flow cytometry. The agronomic traits and nutritional quality of diploid and autotetraploid cucumbers were identified. The results showed that 0.4% colchicine treatment for 4h had the best effect on inducing autetraploid， and the induction rate was 18%， 0.2% colchicine treatment for 2 h had the best effect on inducing triploid and misoploid seeds， and the induction rate was 15%. Compared with diploid， autotetraploid showed shorter internode， grey-green leaf color， increased leaf area， female flower organs and stomata， four-hole pollen grains， double chromosome and DNA content， fruit shape index decreased by 35.66%， soluble sugar content and hardness increased by 91.74% and 34.73%， respectively. This study laid a technical foundation for the creation of cucumber polyploid germplasm.

Key words： Cucumber; Colchicine; Polyploid; Flow cytometry; Fruit quality

黃瓜（Cucumis sativus L.，CC，2n=2x=14），又名青瓜、胡瓜，屬于葫蘆科黃瓜屬，是世界十大蔬菜之一[1]。黃瓜營養豐富，含維生素C、蛋白質、糖類和人體必需的有益礦物質，具食療價值，深受人們喜愛，在我國設施蔬菜生產和周年供應中占有重要地位[2]。因黃瓜栽培種的遺傳基礎狹窄，不僅限制了其產量和品質的進一步改良，而且使黃瓜對逆境環境的適應能力減弱[3-4]。

多倍體是大多數陸地植物譜系中存在超過2套完整染色體組的生物體，是促進生物進化和遺傳多樣性的重要力量[5]。多倍體植物因其具有較強可塑性，即染色體多倍化后拓寬了物種的遺傳變異范圍及增強了對外界脅迫的緩沖能力，有利于創建優質、高產的新品種和增強植物的抗病、抗逆能力[6]。迄今為止，多倍體育種已廣泛應用在西瓜、甜瓜、黃瓜、番茄、馬鈴薯、白菜、蘿卜等蔬菜作物的育種工作中。例如，利用多倍體的巨大性培育出的同源四倍體蘿卜小頂紅，與其二倍體相比，氣孔、花粉粒、花器官、葉片和肉質根等都增大，同時表現出高可溶性糖、可溶性蛋白和維生素C等優良品質[7];利用多倍體低育性培育出優質高產無籽西瓜津蜜55、雪峰新二號等新品種[8-9];利用多倍體抗病、抗逆性強等特點，培育出抗病毒病、軟腐病、霜霉病和抗逆性強四倍體白菜品種多維462[10];利用染色體多倍化可以克服遠緣雜交障礙培育新品種。

蔬菜多倍體種質創制是培育優質高產蔬菜新品種的一個重要途徑，為蔬菜品質性狀遺傳改良與種質創新提供了一個新思路[11]。目前黃瓜多倍體材料陸續被創制出來，如利用秋水仙素誘導子葉期幼苗、萌動種子或干種子分別獲得歐洲溫室型、華北型無毛黃瓜同源四倍體等[12-15]。但關于不同誘導技術體系的誘導效應的比較研究鮮有報道。鑒于此，筆者以津研四號黃瓜為試材，采用不同濃度秋水仙素對干種子、萌動種子和子葉期幼苗進行誘導處理，通過形態學、細胞學、流式細胞術鑒定，探究不同誘導體系的多倍化效應，并對二、四倍體黃瓜進行農藝性狀和營養品質鑒定。以期篩選最優的多倍體誘導與鑒定體系，為豐富黃瓜種質資源提供技術理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2019年8—12月在河北科技師范學院園藝中心實驗室和園藝園林試驗站1號日光溫室中進行。供試材料為津研四號黃瓜（2n=2x=14），購于山東魯蔬種業有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 誘導劑配制 0.2%、0.3%和0.4%秋水仙素溶液配制：分別稱取0.2、0.3、0.4 g秋水仙素粉末于小燒杯中，加入100 μL 95%酒精助溶，再加50 mL蒸餾水溶解后倒入100 mL容量瓶中定容。完成后裝入棕色瓶，整個配制過程避光，4 ℃保存備用。

1.2.2 多倍體誘導 子葉期誘導、種子期誘導和萌動種子期誘導的樣本量均為50粒種子，以蒸餾水處理為對照。子葉生長點誘導（T1）：經溫湯浸種與催芽后的種子播種于50孔穴盤內，于日光溫室中育苗。待子葉展平后，將棉球置于生長點，用膠頭滴管吸取0.3%秋水仙素溶液，滴于棉球上，完全浸濕棉球。每日9：00和17：00處理，共計6次。萌動種子誘導（T2）：50粒種子溫湯浸種后種子放置28 ℃恒溫箱中催芽，待胚根長度至0.3～0.5 cm，用0.4%秋水仙素處理，蒸餾水作對照，于搖床（震蕩速度為50 r·min-1）上避光處理2 h，處理后用清水沖洗3次，播于50孔穴盤。吸脹種子誘導（T3）：種子浸種2 h后，放入50 mL移液管中，加入3.5 mL的0.2%秋水仙素溶液，避光處理2 h，處理完畢用清水沖洗3次，播于50孔穴盤。相關指標測定公式為：致死率/%=死亡的株數/總株數×100，誘變率/%=產生變異的株數/總株數×100。

1.2.3 流式細胞儀鑒定 取對照株（2x）與誘變株黃瓜葉片0.2 g置于熒光染料DAPI緩沖液內，用手術刀切碎，懸浮液經20 μmol·L-1尼龍網過濾，調整細胞核密度至 10萬～30萬個·mL-1。用流式細胞儀檢測每個細胞和熒光信號強度，并經儀器自動分析。選擇通道，上機5000個顆粒，進行分析[16]。

1.2.4 形態學觀察 于苗期和結果期分別觀察對照與誘變株的形態特征，調查苗期子葉、節間、分枝性、葉色、葉形、花器官、果實外觀品質性狀等指標，其測定方法參考黃瓜種質資源描述規范[17]。

1.2.5 細胞學觀察 花粉粒觀察：于晴天9：00—10：00選取長勢旺盛的對照與誘變株（當代）的開放花朵，在載玻片中央滴1滴清水，用手撥動花朵，將花粉散落于清水中，輕蓋蓋玻片，置于顯微鏡下觀察[18-19]。染色體觀察：于8：00取未開放雄花，用鑷子取出花藥，散落放入載玻片上，滴加品紅染色液，烤片再壓片，置于顯微鏡下觀察[20]。

1.2.6 果實營養品質測定 采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[21]，采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量[22]，采用2-6二氯酚靛酚滴定法測定維生素C含量[23]，采用數字折光儀測定可溶性固形物含量，采用果實硬度顯示計測定果實硬度。

1.2.7 數據統計與分析 利用Microsoft Excel 2010和DPS 9.01軟件進行黃瓜形態指標、誘變指標、果實營養品質指標等相關數據的錄入及統計學分析。

2 結果與分析

2.1 秋水仙素對黃瓜多倍體誘導的效果

對比黃瓜多倍體誘導的3種秋水仙素處理方法發現，形態變異率均在40%以上，0.4%秋水仙素處理萌動種子4 h（T2）的DNA誘變率最高，高達18%，但同時致死率也最高，為28%。0.3%秋水仙素處理子葉期黃瓜生長點6次（T1）的誘導效果，其致死率最低，為22%，但DNA誘變率也最低，為9%。0.2%秋水仙素處理種子2 h（T3）的致死率和DNA誘變率均居中，分別為24%和15%（表1）。

通過對二倍體對照和誘變株的苗期（日歷苗齡相同）觀察，發現3種秋水仙素誘導方式下，幼苗的生長速度明顯不同，速度從大到小依次為子葉期T1、種子期T3和萌動種子期T2處理;葉形、葉色均發生改變，主要表現在誘變株葉面積增大、葉色變深、葉片加厚、葉緣呈鋸齒狀等方面（圖1）。

為了準確鑒定出誘變株的倍性，分別提取對照和誘變株的基因組DNA，利用流式細胞儀進行植株的倍性分析與鑒定。研究發現，誘變株中存在未發生加倍的二倍體（2x）和發生倍性變異的三倍體（3x）、四倍體（4x）、二倍體和四倍體混倍體（2x +4x）、八倍體和十六倍體混倍體（8x+16x）等（圖2）。由表1可知，子葉生長點處理的DNA誘變率為9%，萌動種子處理的DNA誘變率為18%;吸脹種子處理的DNA誘變率為15%，誘導三倍體（3x）、四倍體（4x）、混倍體（2x +4x）、混倍體（8x +16x）概率分別為3.5%、2.5%、2.8%和6.2%（流式細胞術測定數據的統計結果）。

2.2 黃瓜二倍體與四倍體形態學比較

對秋水仙素處理前后植株的營養器官進行形態學的觀察和測量，發現四倍體植株較二倍體植株（相同日歷苗齡）較矮壯，主莖較粗，差異顯著。其中莖橫徑增幅達29.79%，節間變短，降幅達12.95%;葉面積大，葉色油亮，葉綠素含量高且增幅達34.07%（表2，圖3）。

四倍體黃瓜與二倍體相比，雌花花瓣長、花瓣寬、子房寬均顯著增大，增幅分別為30.63%、42.24%、25.00%，花冠褶皺程度高;但雄花花瓣長、花瓣寬分別顯著減小29.91%、6.42%，雌花子房長極顯著減小33.91%（圖4，表3）。

四倍體黃瓜與二倍體相比，單瓜質量顯著增大，瓜長顯著減小6.23%，瓜橫徑極顯著增大51.96%，果形指數極顯著減小，瓜把長顯著減小20.70%，瓜把橫徑顯著增大8.37%（圖4，表4）。

2.3 黃瓜二倍體與四倍體細胞學鑒定

利用花粉母細胞制片觀察發現，四倍體（4x）花粉粒存在畸形現象且有4個萌發孔，而二倍體黃瓜花粉粒大小一致性高，有3個萌發孔（圖5-a）。四倍體（4x）較二倍體（2x）染色體個數加倍，由原來的14條染色體加倍為28條染色體（圖5-b）。

2.4 黃瓜二倍體與四倍體果實營養品質比較

四倍體較二倍體黃瓜的維生素C含量、可溶性固形物含量、果實硬度均顯著增高，可溶性糖含量極顯著增高，其中可溶性糖含量、硬度、維生素C含量增幅分別達91.74%、34.73%和11.10%（表5）。四倍體黃瓜可溶性蛋白含量較二倍體顯著下降26.16%（表5）。

3 討論與結論

多倍體誘導是創制新種質的重要途徑之一[20]。目前人工誘導植物多倍體的方法有生物誘導、物理誘導和化學誘導，其中化學誘導主要是利用化學試劑如秋水仙素、植物激素及其他植物堿等人工誘導多倍體?；瘜W誘導又分為體外誘導和體內誘導，體內誘導植物多倍體一般處理植物細胞分裂較旺盛的部位，常用方法包括浸種、涂抹生長點、浸芽等[24]。陳勁楓等[12]利用0.4%秋水仙素處理華北型黃瓜干種子和萌動種子4 h，獲得黃瓜四倍體植株，加倍率26.7%;武婭歌等[13]利用0.3%秋水仙素處理歐洲溫室型黃瓜子葉期生長點5次，獲得黃瓜四倍體植株和非整倍體植株，誘導率4%;劉永月等[14]利用0.4%秋水仙素和2%二甲基亞砜混合溶液處理萌動種子4 h，獲得無毛黃瓜四倍體，誘導率14%;鄢郁霖等[15]利用0.8%秋水仙素處理干種子和萌動種子4 h，獲得了露地型黃瓜四倍體，誘導率分別為1.81%和7.27%。筆者以津研四號為試材，綜合前人最佳的多倍體優化體系，以種子期、萌動種子期和子葉期材料進行不同濃度秋水仙素處理，通過形態學與DNA含量鑒定，成功獲得了四倍體材料。通過比較3種誘導體系發現，0.4%秋水仙素處理萌動種子4 h誘導四倍體的效果最佳（誘導率18%），0.2%秋水仙素處理種子2 h誘導三倍體和混倍體效果最佳（誘導率15%），而0.3%秋水仙素處理子葉期生長點6次（誘導率9%）效果低于前2種方式。以上結果與前人研究基本一致，0.4%秋水仙素處理萌動種子4 h可作為黃瓜四倍體誘導的最優技術體系[12-15]。

基因劑量效應使多倍體細胞體積、植物器官增大，細胞內含物增多，往往表現出巨大性、高抗性，因而多倍體被認為是植物進化的加速器[25-26]。筆者誘導的四倍體植株在形態學特征上與二倍體相比差異明顯，四倍體較二倍體植株生長遲緩，但莖橫徑、葉寬、葉面積、雌花和果形指數均增大，節間長度、雄花、果實長度均減小。四倍體與二倍體細胞學特征比較發現，四倍體花粉粒較二倍體的體積增大，可能原因是四倍體有4個萌發孔，而二倍體僅有3個萌發孔。與前人報道相比，除雄花減小外，其他各指標變化趨勢相一致[12-15]。

在果實外觀品質方面，四倍體較二倍體最顯著的特征是果實變短變粗即果形指數減小，瓜把縮短且果實硬度變大;在果實營養品質方面，四倍體較二倍體可溶性糖含量、維生素C含量、可溶性固形物含量顯著增加。關于黃瓜多倍體營養品質方面的報道很少，但是與其他蔬菜如蘿卜、白菜、甜瓜等多倍體相比較是相一致的，黃瓜多倍體的營養品質變化也是向更有利于物種進化的方向變異[27-28]。本研究為黃瓜多倍體育種提供了技術支持，為雙子葉植物多倍體育種提供了參考。

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