不同發酵方式制備沙丁魚下腳料速釀魚露

趙帥東,尹軒威,劉宇,楊梓璐,劉婷,周婉婷,陳雨瀅,汪立平,2,3*,寧喜斌*

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306) 2(農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海,201306) 3(上海海洋大學 食品熱加工工程技術研究中心,上海,201306)

沙丁魚是我國重要的經濟魚類,加工過程中大約產生30%的下腳料,主要包括頭、內臟、皮和尾等。目前,只有小部分沙丁魚下腳料被用于制作魚粉和動物飼料,大部分被丟棄。這些下腳料含有豐富的有價值的生物材料,如蛋白質、脂類和酶。因此,有必要將這些下腳料轉化為高附加價值產品。

魚露是利用價格低廉的魚蝦或水產品加工中的下腳料,加入30%～40%的鹽,在太陽下暴曬發酵1～2年得到的產品[1]。因此,可以利用沙丁魚下腳料來制備魚露,這樣不僅能減少環境污染問題,還能夠提高沙丁魚下腳料的經濟價值。不過,傳統魚露的發酵的周期長,生產效率低,不利于工業化。因此,縮短魚露的發酵周期,提高企業的生產效率一直是研究的重點。目前,縮短魚露的發酵周期的主要方法包括：保溫法、外加酶、外加曲法以及微生物發酵法。LOPETCHARAT等[2]發現把太平洋鱈魚的發酵溫度提高到50 ℃時,其發酵15 d時發酵液中總氮的含量與商品魚露相一致。李勇等[3]以鯽魚為原料,采用復合酶解的方法,先加胰蛋白酶后加入木瓜蛋白酶,得到的成品魚露的各項指標達到了國標要求,有效地縮短了生產周期。白政澤等[4]采用加曲適量保溫的方式生產魚露,發酵30 d得到了一級魚露。YONGSAWATDIGUL等[5]從泰國魚露的發酵過程中分離出來了Virgibacillussp.SK33,并以此作為細菌發酵劑,能夠把魚露的發酵時間由12個月降低到4個月。本研究采用4種發酵方式制備魚露,通過監測發酵過程中理化指標探討每一種發酵方式的優缺點,旨在為水產品加工下腳料的高值化利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙丁魚下腳料(魚頭、魚尾、魚骨和內臟等),由寧波佳必可食品有限公司提供,使用前置于冰箱-20 ℃冷凍備用。傳統發酵的商業一級魚露,山東威海某公司；復合蛋白酶(1.5 AU/g)、風味蛋白酶(500 LAPU/g),諾維信(中國)生物技術有限公司；曲霉菌YL001、貝萊斯芽孢桿菌S2(BacillusvelezensisS2),本研究室保藏；種子培養基(g/L)：可溶性淀粉10,牛肉膏5 g,NaCl 50 g；其他化學試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

JYSA800型絞肉機,九陽股份有限公司；PHS-3C型 pH 酸度計,上海儀電科學儀器股份有限公司；Kjeltec 8400型全自動凱氏定氮儀,丹麥福斯分析儀器公司；H2050R型高速冷凍離心機,湖南湘儀離心機儀器有限公司；SPX-250B-Z生化培養箱,上海博訊實業有限公司醫療設備廠；7200可見分光光度計,尤尼柯(上海)儀器有限公司；數顯式恒溫水浴鍋,上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SPME手柄與萃取頭,美國Supelco公司；7890 N/5975C氣質聯用儀,美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙丁魚下腳料魚露的制備

冷凍的沙丁魚下腳料在流水中解凍1 h后,用絞肉機將其斬拌成魚糜,然后與蒸餾水按1∶1(g∶mL)的比例混合,并裝在1 000 mL玻璃罐中,接著用4種發酵方法制備魚露(如圖1)。

圖1 沙丁魚下腳料制備魚露流程圖Fig.1 Flow chart of preparation of fish sauce from sardine by-products

(1)雙酶酶解法。先加質量分數0.5%(酶/魚糜)的復合蛋白酶,在50 ℃水浴2.5 h,再加入質量分數0.7%(酶/魚糜)風味蛋白酶,在55 ℃繼續水浴2.5 h,最后加入質量分數15%的鹽(鹽/混合物)后,發酵后所得魚露為魚露A。

(2)雙酶酶解與發酵劑復合發酵法。將前期從自然發酵魚露篩選得到的1株產蛋白酶的貝萊斯芽孢桿菌S2,接到種子培養基(60 mL/250 mL),37 ℃、80 r/min振蕩培養20 h。然后通過雙酶酶解得到酶解液,加入魚糜質量5%的貝萊斯芽孢桿菌S2種子培養液離心(8 000 r/min,4 ℃,15 min)后的得到菌體以及質量分數15%的鹽(鹽/混合物),發酵后所得魚露為魚露B。

(3)雙酶酶解與YL001曲復合發酵法。曲霉菌YL001是從醬油曲篩選出來的高產蛋白酶菌,YL001曲的制備參照白政澤等[4]方法。首先通過雙酶酶解得到酶解液,然后加入質量分數14%的YL001曲(曲/魚糜)以及質量分數15%的鹽(鹽/混合物),發酵后所得魚露為魚露C。

(4)僅加YL001曲法。先在50 ℃水浴中自溶2.5 h,然后在55 ℃繼續水浴2.5 h,然后加入質量分數14%的YL001曲(曲/魚糜)以及質量分數15%的鹽(鹽/混合物),發酵后所得魚露為魚露D。

為了得到更高品質的魚露,所有樣品都先在35 ℃的恒溫培養箱中保溫發酵30 d,然后在室溫(15～25 ℃)下發酵60 d。

1.2.2 pH的測定

用pH計直接測量魚露樣品的pH值。

1.2.3 總酸及氨基酸態氮(amino acid nitrogen,AAN)含量的測定

參考GB 5009.235—2016中甲醛滴定法。

1.2.4 總氮的測定

GB 5009.5—2016中的凱氏定氮法。

1.2.5 揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)的測定

參考GB 5009.228—2016的自動凱氏定氮儀法。

1.2.6 揮發性化合物的鑒定

魚露的揮發性成分的測定參考GAO等[6]方法。將5 mL過濾后的魚露樣品放入頂空進樣瓶,插入萃取頭于60 ℃下吸附30 min。再迅速插入進樣口,250 ℃下解吸5 min。

GC色譜柱為HP-5MS柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；升溫程序：初始溫度40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min的速度升溫至90 ℃,再以8 ℃/min的速度升溫至230 ℃,保持7 min。載氣He,流速1.0 mL/min。質譜離子源溫度 230 ℃,電子能量 70 eV；不分流進樣；質量掃描范圍m/z35～550。

1.2.7 感官評價

采用描述性定量分析(quantitative descriptive analysis,QDA)法對魚露樣品進行感官評價分析[7]。評價小組由9名研究生(5名男性和4名女性,年齡24～30歲)組成。在感官評價之前,先進行了魚露風味描述的一致認定和培訓。經過訓練的組員對不同風味的魚露(焦糖味、肉味、鮮味、酸味、苦味、魚腥味、氨味、腐臭味)進行評分。計分采用10分制,“1”分代表該風味完全沒有,“10”分代表該風味非常強烈。

2 結果與分析

2.1 不同發酵方法制備沙丁魚下腳料魚露過程中pH的變化

如圖2所示,發酵過程中A、B、C和D 4種魚露的pH值的變化趨勢相似。它們的pH值均在發酵的前15 d升高,緊接著(除A外)pH值又逐漸下降。發酵過程中pH變化的原因是揮發性堿基氮類化合物及有機酸類化合物在不同的發酵階段生成量不同[7]。在發酵前期pH的上升可能是因為沙丁魚下腳料的蛋白質被降解成小分子的胺、氮等堿性物質含量比例較大所致,而后來pH下降可能是因為蛋白質被分解為氨基酸、多肽及脂肪等被分解為一些有機酸類化合物。發酵結束后,魚露A、B、C和D的pH值分別為6.34、6.23、5.90和5.78,差異顯著(P<0.05)。魚露C、D的pH值比魚露A、B的pH值低,這說明雙酶酶解與YL001曲復合發酵法及僅加YL001曲法能夠把原料的蛋白質、脂肪等物質分解更完全。

圖2 魚露發酵過程中pH值的變化Fig.2 Changes of pH during fish sauce fermentation process

2.2 不同發酵方法制備沙丁魚下腳料魚露過程中總酸和AAN的變化

發酵過程中總酸含量的變化如圖3所示?？偹岷恐饕c蛋白質分解產生的氨基酸、胺類化合物以及發酵過程在產生的有機酸有關。由圖3可知,魚露A和B在發酵初期總酸略微下降,隨后趨于平穩；魚露C和D在發酵初期下降后,隨后酸度又增加,最后趨于平穩。魚露C和D的總酸度比魚露A和B高,說明加入YL001曲促進了原料中的蛋白質及脂質的分解,導致酸類物質較高。魚露B的酸度高于魚露A的酸度,說明加入貝萊斯芽孢桿菌S2也能促進沙丁魚下腳料的分解,不過分解能力弱于YL001曲；魚露D的酸度高于魚露C的酸度,這可能是因為在加入商業蛋白酶后產生了較多的堿類物質。

圖3 魚露發酵過程中總酸的變化Fig.3 Changes in total acids during fish sauce fermentation process

AAN是一個衡量魚露質量的重要指標。我國魚露的行業標準SB/T 10324—1999《魚露》規定一級魚露AAN的含量應大于9.0 g/L,二級魚露AAN的含量應大于6.5 g/L；而日本CODEX STN 302—2011規定魚露AAN含量應大于總可溶性氮(total soluble nitrogen,TSN)含量的40%[8]。如圖4所示,4種發酵方法所制備魚露中的AAN的含量均隨著發酵時間的增加不斷地增加,在發酵的前30 d即保溫發酵過程中,AAN含量增加迅速,當進入室溫發酵后,AAN含量增加緩慢。AAN的含量變化代表著魚露中主要氨基酸濃度的變化,與魚中多肽和蛋白質降解的聯合作用有關[9]。

圖4 魚露發酵過程中氨基酸態氮(AAN)含量的變化Fig.4 Changes in conttent of amino nitrogen during fish sauce fermentation process

在整個發酵過程中,雙酶酶解與YL001曲復合發酵法制備的魚露的AAN含量最高,其次是僅加YL001曲法,然后是雙酶酶解與發酵劑復合發酵法,最低的是雙酶酶解法。經過90 d的發酵,魚露A、B、C、D的AAN的含量分別為8.0、8.5、11.0及10.0 g/L,差異顯著(P<0.05)。魚露A和B達到了我國二級魚露的AAN標準,而魚露C和D達到了我國一級魚露的AAN標準。

2.3 不同發酵方法制備沙丁魚下腳料魚露過程中TSN的變化

TSN是另一個衡量魚露質量的重要指標,我國魚露的行業標準SB/T 10324—1999《魚露》規定,一級魚露TSN的含量應大于12.0 g/L,二級魚露TSN的含量應大于8.7 g/L；而日本CODEX STN 302—2011以及韓國規定,魚露TSN含量應大于10.0 g/L[8-9]。魚露樣品中TSN含量如圖5所示,與AAN的變化趨勢相似(圖4),都是隨著發酵時間的延長而不斷增加。這主要是因為沙丁魚下腳料中的蛋白質在原料所含的蛋白酶、添加的商業蛋白酶、YL001曲或者貝萊斯芽胞桿菌S2分泌的酶與一些微生物的降解的共同作用的結果[10-11]。在發酵的整個過程中,不同發酵方式所制備的魚露的TSN含量高低與AAN指標的趨勢完全一致。發酵結束,魚露A、B、C、D的TSN的含量分別為10.6、11.2、13.7及12.8 g/L,存在顯著性差異(P<0.05)。因此,結合AAN以及TSN的含量,可知魚露A和B為二級魚露,魚露C和D為一級魚露。

圖5 魚露發酵過程中可溶性總氮(TSN)的變化Fig.5 Changes in total soluble nitrogen during fish sauce fermentation process

經過3個月的發酵,雙酶酶解與YL001曲復合發酵法是所得魚露的質量最高；僅加YL001曲所得魚露的質量雖然低于雙酶酶解與YL001曲復合發酵法,但是也能夠達到我國一級魚露的標準,且不加商業蛋白酶能夠降低企業的生產成本,從而更有利于魚露的產業化；雙酶酶解與發酵劑復合發酵法所得魚露質量低于上面兩種發酵方式,得到了接近一級魚露標準的魚露產品；雙酶酶解法所得魚露質量是4種發酵方式中最低的,不過也達到了二級魚露標準,這為企業制造中低端的魚露產品提供了一種方法。

2.4 不同發酵方法制備沙丁魚下腳料魚露過程中TVB-N的變化

發酵過程中TVB-N含量的變化如圖6所示。在發酵的前30 d,TVB-N的含量均顯著增加,但是隨后緩慢增加。TVB-N,包括氨、三甲胺等揮發性堿性氮化合物,是衡量海產品新鮮度和變質程度的重要指標[12]。TVB-N的積累一般與原料的腐敗以及特定腐敗菌的生長有關系[13]。經過90 d的發酵,魚露A、B、C、D的TVB-N的含量分別為1.42、1.48、2.38和2.18 g/L。魚露A和B的TVB-N含量不存在顯著性差異(P>0.05),這說明加入貝萊斯芽孢桿菌S2后并不會使TVB-N的含量顯著增加,因此具有良好的應用前景。酶與YL001曲復合發酵法和僅加YL001曲法所得魚露產品的TVB-N含量相近,但是前兩種發酵方式的TVB-N含量顯著低于后兩種發酵方式(P<0.05),這是可能是因為加入YL001曲后,在水解蛋白質的過程中產生了一些揮發性堿類化合物,因此魚露A和B的安全性更高。

圖6 魚露發酵過程中揮發性鹽基氮(TVB-N)的變化Fig.6 Changes in TVB-N during fish sauce fermentation process

2.5 揮發性化合物的分析

通過SPME-GC-MS檢測了發酵90 d后的魚露A、B、C、D以及傳統發酵的商業魚露樣品的揮發性化合物,其中主要包括醛類、醇類、酮類、酯類、烴類、含氮化合物等。

如增強出版附件表1所示,醛類物質在魚露A、B、C、D中的相對含量分別為47.19%、31.46%、33.89%和29.35%。醛類來自發酵過程中的脂質氧化,其中支鏈短鏈醛類或芳香族醛類可能是由氨基酸脫氨作用產生[14]。醛類一般具有令人愉快的氣味,而且由于醛類的閾值較低,所以醛類有助于形成發酵魚的獨特香味[15]。在傳統發酵的商業魚露以及魚露A、B、C、D中均檢測到了3-甲基丁醛,而3-甲基丁醛被認為是魚露特有風味的來源[11],這說明4種發酵方式均能使沙丁魚下腳料魚露具有傳統發酵魚露的特征性風味物質。此外,魚露A、B、C、D中均檢測到了2-甲基丁醛,它被認為是魚露中重要的風味物質[15]。另外,在傳統發酵的商業魚露和4種魚露中均檢出大量苯甲醛和苯乙醛,不過苯甲醛和苯乙醛對魚露氣味的影響不大。庚醛是魚腥味的主體成分[16],在4種魚露中均檢測到,傳統發酵的商業魚露中沒有檢測到,這可能是因為商業魚露經過了脫腥處理。

醇類物質閾值較高,它們通常不會影響魚露的整體氣味[5]。魚露D中檢測到了3-甲基-1-丁醇,這種物質通常與強烈的蘑菇和草的氣味有關[17],是大豆醬油中產生芳香作用的化合物[18],這說明魚露D的風味接近大豆醬油。1-辛烯-3-醇是不飽和脂肪酸的氧化產物,能產生類似蘑菇的氣味[17],這種物質僅在魚露B和魚露D中檢測出。酮類物質一般與微生物活動和脂類的氧化有關,具有高閾值,可能對魚露的氣味沒有貢獻,不過烯酮能增強魚的腥味。酯類物質在魚露A、B、C、D中的相對含量分別為8.12%、4.51%、11.84%和10.15%,傳統發酵的商業魚露的酯類物質含量為20.16%。除了賦予水果花香的特性,酯類還能減弱或掩蓋不愉快的游離氨基酸衍生的氣味。

4種魚露中均檢測到了含氮化合物,它主要來源于氨基酸和碳水化合物之間發生的美拉德反應或氨基酸的熱分解[16]。三甲胺是腥味物質的主要來源,在4種魚露中均檢測到,不過傳統發酵的商業魚露中沒有檢測到。2-乙基呋喃的閾值較低,有助于產生青草味或者豆香味[16],魚露B和D中2-乙基呋喃的相對含量較高,豆香味較濃。烷烴類由于風味閾值較高,一般對風味沒有重要影響[19]。酸類物質對魚露的酸味有重要作用,在傳統發酵的商業魚露中檢測出的4-甲基-戊酸具有刺激的酸味,在4種魚露中均未檢測到。不過,具有奶酪味的2-甲基丁酸僅在傳統發酵的商業魚露中檢測到。另外,在傳統發酵的商業魚露以及魚露A、B和C中均檢測到了二甲基二硫,它是造成魚露獨特氣味的有效化合物[5],這說明魚露A、B和C具有和傳統發酵魚露相近的風味。

采用雙酶酶解法、雙酶酶解與發酵劑復合發酵法所得魚露產品的腥味較重,風味相對較差；采用雙酶酶解與YL001曲復合發酵法的腥味最輕、風味最佳,僅加YL001曲法所得魚露風味較接近于大豆醬油。雖然用4種發酵方式生產出的沙丁魚下腳料魚露不及傳統發酵魚露的風味濃郁,但已經具有傳統發酵魚露的特征性風味。

2.6 感官評價

4種魚露的感官評價如圖7所示,4種魚露的苦味、酸味、氨味、腐臭味得分都較低,這說明4種發酵方式所得魚露產品均無特別強烈或難聞的味道。魚露C和魚露D鮮味和焦糖味高于魚露A和B,這是因為加YL001曲后促進了原料中蛋白質等成分的降解,而其降解產物,如氨基酸、TSN等成分能夠促進魚露中鮮味和焦糖味的形成。另外,雖然與傳統發酵的商業魚露相比4種魚露的風味和滋味較差,但是4種魚露的整體接受性良好,尤其是魚露C已經和傳統發酵的商業魚露質量相差不大。

圖7 魚露樣品的感官評價Fig.7 Sensory evaluation of fish sauce samples

3 結論

本研究為了探索利用沙丁魚下腳料制作魚露的可能性,采用4種發酵方式來制備魚露。利用雙酶酶解與YL001曲復合發酵法所得的魚露樣品C的質量最高,風味最好,達到了一級魚露標準。僅用YL001曲法所得的魚露樣品D質量雖然低于前者,但是也達到了一級魚露標準,且不添加商業蛋白酶能夠極大的降低企業的生產成本,更有利于魚露的工業化。雙酶酶解與發酵劑復合發酵法所得的魚露樣品B的質量接近于一級魚露,其安全性更好,因此有良好的應用前景。雙酶酶解法所得魚露A的質量最低,但也達到了二級魚露。4種發酵方式所得的魚露產品通過GC-MS均檢測到了3-甲基丁醛、2-甲基丁醛等魚露特征性風味物質,感官評價也表明魚露產品均富有傳統發酵魚露固有的鮮美滋味。因此雖然4種發酵方式各有優缺點,但均能利用沙丁魚下腳料來生產魚露。