一例由疫苗接種引起的商品肉雞多病原混合感染

盛曉丹 郭卉 秦春芝 劉霞 黃迪海 徐懷英 秦桌明

摘 要：為確診山東某商品肉雞群發病的原因，采集病死雞的喉頭、氣管等組織，分別進行核酸和病原分離鑒定。結果顯示，傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）和禽腺病毒4型（FAdV-4）等特異性PCR均呈陽性，而新城疫病毒（NDV）、低致病性禽流感H9N2等均為陰性。測序結果表明，ILTV分離株（PY）與疫苗株（K317）ICP4基因的核苷酸同源性為100%;而IBV分離株（PY）與疫苗株H120、4/91N基因的同源性分別為86.4%、86.6%，顯示出較大的差異。CAM途徑接種雞胚分離出腺病毒，且對SPF雞胚具有一定的致病性。同時，從病雞肝臟中分離到大腸桿菌，藥敏試驗證實對多粘菌素B、健牧茶多酚、阿莫西林棒酸、頭孢噻肟敏感，采用敏感藥物治療后取得一定的臨床治療效果。綜上所述，該病是一起由疫苗接種應激而引起的多病原混合感染。

關鍵詞：傳染性喉氣管炎病毒;禽腺病毒4型;傳染性支氣管炎病毒;大腸桿菌;混合感染

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2021）11-0039-06

2021年4月于山東某商品肉雞場發現一起嚴重呼吸道癥狀的病例。該場肉雞于7日齡免疫新支二聯活疫苗（La Sota株+H120株），19日齡采用點眼方式接種傳染性喉氣管炎活疫苗（K317株），免疫2 d后出現呼嚕聲、咳嗽，嚴重者有引頸呼吸等呼吸困難的癥狀，并迅速波及全群，死淘率逐日攀升，多種藥物治療效果不佳。臨床剖檢發現喉頭、氣管粘膜出血嚴重，氣管內有大量的紅色粘液，細支氣管內有黃色栓塞物，個別雞出現心包炎、氣囊炎、心包積液增多的癥狀，疑似病毒和細菌混合感染。筆者采集死亡雞只的氣管、肺、喉頭、肝臟等組織樣品進行病毒的PCR鑒定及細菌分離與藥敏試驗，確認肉雞發病及死亡原因，為此次病情的預防控制和科學用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、材料和儀器

Simply P病毒DNA/RNA共提取試劑盒，購自杭州博日科技有限公司;DNA回收試劑盒，購自天根生物科技有限公司;Reverse Transcriptase M-MLV、TaKaRa Taq HS Perfect Mix、DL2000 bp DNA Marker，購自寶生物（北京）有限公司;藥敏片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司;健牧茶多酚藥敏紙片，自制（200 μg/片）;10日齡SPF雞胚，由山東省農業科學院家禽研究所提供;PCR儀（TC-XP型），購自杭州博日科技有限公司。

1.2 引物的設計與合成

參照GenBank中FAdV-4、ILTV、IBV、新城疫（NDV）和H9亞型AIV的經典序列，應用Primer Premier 5. 0軟件設計合成特異性引物，由北京六合華大基因有限公司合成。病毒檢測引物見表1。

1.3 病料處理

剖檢具有典型癥狀的發病雞或死亡雞，取其氣管或刮取粘液、肺、脾臟作為病料，剪碎、勻漿，反復凍融3次后，1 2000 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃保存備用。將可疑病料命名為PY。

1.4 病毒核酸提取

按照Simply P病毒DNA/RNA共提取試劑盒說明書提取上清液中的RNA和DNA。

1.5 IBV、AIV H9、NDV反轉錄

取經DNaseⅠ處理過的1 μg總RNA為模板，加Random Primer（0.5 μg/μL）1 μL，按照Reverse Transcriptase M-MLV試劑說明書進行反轉錄，獲得cDNA作為PCR反應模板。

1.6 病毒核酸PCR鑒定

以cDNA和提取的總DNA為模板，采用表1的引物分別進行PCR擴增。

PCR反應體系25 μL：2×TaKaRa Taq HS Perfect Mix 12. 5 μL、上下游引物（10 μmol/L） 各0.5 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 9. 5 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 個循環;72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存備用。取10 μL PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀中觀察并記錄結果，回收目的條帶進行測序。利用Lasergen 7.1和MEGA 5軟件對測序結果進行同源性比較與進化樹分析。

1.7 病毒分離

取1.3中制備的病料上清，利用0.22 μm過濾器除菌，分別接種10日齡SPF雞胚絨毛尿囊膜（CAM）和尿囊腔，棄24 h內非特異性死亡的雞胚，37 ℃培養96 h，分別無菌收集尿囊液和CAM，盲傳3代，觀察雞胚病變，提取CAM的DNA樣本和尿囊液的RNA樣本進行核酸檢測。

1.8 細菌分離與藥敏試驗

1.8.1 細菌分離 無菌操作采集肝臟組織樣品，劃線接種血液瓊脂培養基，于37 ℃培養24 h，挑取灰白色菌落接種于麥康凱培養基，37 ℃培養24 h后挑取粉紅色菌落，進行鑒定及藥敏試驗。

1.8.2 16S rDNA分子鑒定 取新鮮制備的分離純化菌液適量，根據細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA為模板，以細菌16S rRNA通用引物為特異性引物進行擴增，PCR反應體系25 μL：2×TaKaRa Taq HS Perfect Mix 12. 5μL、通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）各0.5 μL、DNA 1 μL、ddH2O 10.5 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 個循環;72 ℃延伸10 min，于4℃保存備用。取10 μL PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀中觀察并進行測序。測序結果與參考菌株進行核苷酸同源性比對。

1.8.3 藥敏試驗 采用Kirby-bauer瓊脂擴散法對分離菌株進行常用抗生素的敏感性試驗，測定抑菌圈直徑，并參考美國臨床和實驗室標準協會（ 2013年）的標準判定其耐藥情況。

2 結果

2.1 病毒核酸檢測

對病雞的氣管粘液檢測顯示，FAdV-4分離株（PY）的片段長度為885 bp;ILTV分離株（PY）的 ICP4基因片段為574 bp;IBV分離株（PY）的N基因片段長度為830 bp;以上均與FAdV、ILTV和IBV的標準陽性對照片段大小相符。但對NDV和H9N2亞型禽流感病毒的核酸檢測陰性（圖1）。

2.2 ILTV和IBV序列同源性分析

利用MegAlign生物信息學軟件進行序列同源性比較。結果顯示，ILTV PY分離株與疫苗株K317株（GenBank 登錄號：JX458824）ICP4基因序列的核苷酸同源性為100%，推測ILTV PY可能為疫苗株;IBV PY分離株（PY01.2021）與中國IBV近期流行株QX株的N基因核苷酸同源性高達93.4%，顯示出較高的同源性，而與國內常用的疫苗株H120和4/91同源性僅為86.4%、86.6%，顯示出較大的遺傳距離（圖2、圖3）。

2.3 病原分離

病料上清無菌處理后，經絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚，120 h內未出現雞胚死亡，且盲傳3代仍未發現雞胚死亡。解剖第3代感染雞胚和未感染雞胚發現：感染雞胚發育不良，注射部位雞胚CAM增厚，形成邊緣凸起、中間凹陷的灰白色痘斑，而對照組雞胚發育正常。收集第3代CAM，提取病毒DNA進行PCR擴增，結果顯示ILTV和FAdV-4均為核酸陽性，與病料檢測結果一致。表明ILTV和FAdV-4感染SPF雞胚能導致雞胚發育異常，但對雞胚不致死。

病料上清無菌處理后經尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚，連續三代感染120 h內未出現雞胚死亡，但感染雞胚發育不良。收集第3代感染36 h的雞胚尿囊液，提取病毒RNA進行RT-PCR擴增，結果顯示IBV為陽性，與病料檢測結果一致。

2.4 細菌分離培養與鑒定

分離株在麥康凱培養基上呈圓形、光滑的粉紅色菌落，經革蘭氏染色后在油鏡下觀察到兩端鈍圓的紅色短桿菌，為革蘭氏陰性菌，疑為大腸桿菌。

分離株16S rRNA擴增條帶大小為1 500 bp左右。該片段測序后與Genbank已有序列進行同源性比對，發現分離菌株與大腸桿菌Escherichia coli strain AH01（CP055251） 的16S rRNA核苷酸同源性較高，為98%，因此鑒定該分離菌為大腸桿菌。

2.5 分離菌耐藥性檢測

由表2可見，分離菌僅對多粘菌素B、頭孢曲松、頭孢噻肟、健牧茶多酚敏感，對阿莫西林棒酸中度敏感，對氨芐西林、阿奇霉素、多西環素、林可霉素、氟苯尼考、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等多數藥物耐藥。

3 討論

本試驗先后從山東某商品肉雞場的病死雞氣管中檢測到ILTV、FAdV-4和IBV，經測序后確診為ILTV、FAdV-4和IBV。進一步比較發現，ILTV片段核酸測序結果與疫苗免疫所用的疫苗株K317的ICP4基因核苷酸同源性為100%，結合該雞場近期曾經免疫過ILTV弱毒疫苗，因此推斷此次疫情是一起由不合理的疫苗使用而引起的多病原混合感染和繼發感染。應引起養殖企業的高度重視。建議養殖企業，在ILTV疫苗免疫前需對需要免疫的雞群進行風險評估，同時做好其他病原的綜合防控工作，防止繼發感染 [1]。

免疫接種是目前預防傳染性喉炎最有效的途徑。ILTV疫苗主要包括雞胚源疫苗（CEO）、細胞源疫苗（TCO）和基因工程疫苗等三大類型。其中，CEO疫苗最為常用，占我國成年雞ILTV活疫苗使用量的70%以上。其優點是：使用方便，適合于滴眼、飲水或噴霧等多種途徑免疫，每種方法均能夠提供較好的群體免疫效果。缺點是：對1月齡以內的雛雞具有致病性，僅適用于4周齡以上的育成雞或成年雞[2]，對雛雞存在一定的安全隱患。此次疫病發生就是一個例證。相反，基因工程疫苗在商品肉雞免疫方面則具有較大潛力。王云峰等（2001）利用FPV為載體，成功表達ILTV中國王崗株gB基因，通過對1日齡雞接種試驗表明，該重組病毒無論對商品雞還是SPF雞的免疫保護均為100%，該疫苗已于2005年獲得國家新獸藥注冊證書[3-5]。在美國，有兩個已批準的商業重組ILTV疫苗：一是由CEVA生產（Biomune公司），該疫苗利用FPV作為載體插入ILTV的gB和UL32基因;二是由Intervet公司生產，是將ILTV的gI和gD基因克隆到火雞皰疹病毒基因中。上述疫苗均適合于胚胎接種或1日齡雛雞接種?？傊?，對于已發生過或周邊發生過疫情的規?；怆u場，建議可接種1日齡雛雞，能有效預防ILT的發生而減少危害[6]。因ILTV是DNA病毒，在環境中的存活能力較強，應延長雞舍空欄期的時間，并采取醛類、含氯消毒劑等進行交叉反復消毒[7]。

本試驗從氣管中檢測到的IBV分離株，與IBV流行株 QX株，其N基因部分序列同源性較高，而與該養殖場近期免疫的H120株和4/91株同源性僅為85.7%和87.2%，因此推斷該IBV分離株可能為野毒株，而非疫苗株。QX型IBV目前仍是山東地區流行的主要毒株，但多數養殖場免疫H120、4/91株，對QX型強毒株感染的保護率較低，而QXL87疫苗株對部分QX型強毒株感染的保護率僅達到80%，達不到100%。因此，養殖企業應盡量選擇與當地流行毒株的血清型一致的疫苗株免疫才能發揮有效的保護作用[8]。

由于傳染性喉氣管炎無特效治療藥物，應快速淘汰病死雞，對其他健康雞群飲用抗病毒中藥、轉移因子等對癥治療，以提高雞群的抵抗力。同時，根據藥敏試驗結果在飼料中添加健牧茶多酚，并與阿莫西林棒酸飲水配伍連用5 d治療大腸桿菌感染。結果，發病雞群采食逐漸恢復正常，死淘率下降，7 d后該養殖場病情得到有效控制。

4 結論

此次發病為ILTV、FAdV-4、IBV和大腸桿菌混合感染，免疫ILTV活疫苗可能是造成此次疫情的誘因。

參考文獻：

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[8] 蘇晉. “雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯活疫苗（La Sota株+QXL87株）”對IBV流行毒株的免疫保護試驗[D].揚州：揚州大學，2018.