漆黃素對高糖誘導視網膜Müller細胞氧化應激炎癥反應的作用

胡千慧，曹睿，凌云，郁盛雪

(1.錦州醫科大學口腔醫學院；2.錦州醫科大學遼寧省糖尿病感知功能障礙重點實驗室，遼寧 錦州 121000)

糖尿病全球發病率逐年升高，流行病學研究表明：到2030年，糖尿病的患病率將增加到7.7%，影響4.39億成年人[1-2]。糖尿病并發癥主要包括神經病變、腎病、視網膜病變及大血管并發癥，其中糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)屬于微血管并發癥，可導致患者視力明顯下降或視野缺失，重者可致失明[3-4]。Müller細胞是視網膜細胞中最主要的神經膠質細胞，與視網膜血管和視網膜神經元密切接觸，主要作用包括神經遞質傳導、調節視網膜血流、維持血視網膜屏障，控制視網膜代謝及營養物質供應，并與DR密切相關[5]。

漆黃素(FIS)是一種黃酮醇，主要存在于水果、蔬菜、堅果、豆類中，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗病毒、抗血管生成、免疫調節及神經保護[6]等多種生物學特性。漆黃素可通過上調還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、SOD水平及減少MDA含量發揮抗氧化作用，從而改善帕金森小鼠腦組織氧化損傷[7]。在小鼠肝缺血再灌注損傷模型中，漆黃素能夠減輕IL-1β、IL-18、TNF-α及NLRP3炎癥小體表達，增加肝組織中p-GSK3β、p-AMPK蛋白表達來減輕肝缺血再灌注損傷[8]。漆黃素還與Akt-GSK3β信號通路密切相關，它通過調節PTEN-Akt-GSK3β信號通路抑制三陰性乳腺癌、肺癌的轉移與侵襲[9]。

有研究證實漆黃素通過抑制 β 淀粉樣蛋白生成和Tau蛋白磷酸化等，減輕神經毒性損傷，改善記憶功能發揮神經保護作用；漆黃素在PD模型中提高MPTP 小鼠腦組織的GSH、SOD、T-AOC 水平，降低MDA 含量，改善 MPTP 誘導的 PD小鼠腦內ROS產生與清除之間的失衡，改善 MPTP 小鼠腦組織的氧化損傷發揮神經保護作用[10]。目前尚不清楚漆黃素是否對DR起治療作用。本研究以視網膜Müller細胞為研究對象，旨在探討漆黃素對高糖條件下Müller的潛在影響及作用，包括ROS的產生、抗氧化應激作用及炎癥因子的表達及其分子機制，為漆黃素治療DR提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

Müller細胞系(上海賓穗生物科技)，漆黃素(純度>98%，成都曼思特生物科技)。DME/F12培養液(Hyclone)，胎牛血清(Aus GeneX)，青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶(索萊寶)，二甲基亞砜(Sigma)，增強型細胞增殖活力(CCK-8)檢測試劑盒(上海尚寶生物科技)，活性氧檢測試劑盒、線粒體膜通透性轉換孔、BCA法蛋白檢測試劑盒、ECL顯影劑、超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛含量試劑盒、JC-1檢測試劑盒(索萊寶)，通用型高靈敏度染料法定量PCR檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技)，反轉錄試劑盒(Thermo)，(IL-β、IL-6 、TNF-α)mRNA(華大基因)，單克隆抗β-Actin(華美生物)，磷酸化絲氨酸-蘇氨酸激酶(p-Akt)、磷酸化糖原合成酶激酶-3 (p-GSK-3β)(Affinity),HRP標記二抗(protein-tech)。細胞微孔板成像系統cytation5(美國Biotek)，倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯)，電泳儀(北京六一)、NANO DROP 2000C(Thermo)、熒光定量PCR儀、化學發光凝膠成像系統(美國伯樂)。

1.2 實驗分組

本實驗分為兩部分，第一部分通過CCK8明確漆黃素生物安全性，確定高糖模型濃度及漆黃素有效濃度。首先在含有Müller細胞的培養基中分別加入不同濃度漆黃素(0、25、50、75、100 μmol/L)作用48 h檢測細胞增殖活力；其次分別加入(0、25、50、100 mmol/L)濃度的葡萄糖作用48 h檢測細胞增殖活力，確定最終高糖模型濃度；最后分別加入(25、50、75、100 mmoL/L)濃度漆黃素預處理2 h后再加入確定后高糖的濃度培養48 h檢測細胞增殖活力,確定漆黃素有效濃度。第二部分實驗分為4組，分別是正常對照組(Control)、高糖組(HG)、漆黃素組(FIS)以及TCBN抑制劑組。Control組：正常培養Müller細胞；HG組：培養基中加入 100 mmol/L高糖培養作用48 h；FIS組：培養基中分別加入75 μmol/L 漆黃素預處理2 h后加入 100 mmol/L高糖培養48 h；TCBN抑制劑組：培養基中加入漆黃素 75 μmol/L+ 1 μmol/L TCBN預處理2 h，然后加入100 mmol/L 高糖培養48 h。以上細胞處理時間及TCBN濃度根據相關文獻確定。

1.3 CCK-8檢測細胞增殖活性

取對數生長期Müller細胞，接種于96孔板中，密度調整至每孔1×105個細胞，每孔100 μL,放入培養箱培養。細胞培養24 h后向各孔加入10 μL不同濃度的葡萄糖和漆黃素，同時設置空白對照組，以每個濃度為1組，每組分別設5個平行復孔。將96孔培養板放入培養箱中繼續培養48 h,每孔加入10 μL增強型CCK-8試劑，放入培養箱孵育2 h，用Cytation5測定490 nm處的吸光度(A)值。細胞存活率(%)=[A(加藥)-A(空白)]/ [A(對照)-A(空白)]×100%。

根據細胞增殖活性檢測結果，最終確定濃度100 mmol/L為高糖模型，75 μmol/L漆黃素是藥物最佳濃度，用于后續實驗。

1.4 氧化應激指標測定

檢測MDA含量和SOD活性，各組Müller細胞給藥處理48 h后收集細胞，超聲波破碎，離心取上清液。采用硫代巴比妥酸比色法測定 MDA 含量，黃嘌呤氧化酶法測定 SOD 活性，嚴格按照試劑盒說明方法進行操作，使用細胞微孔板成相系統(Cytation5)405 nm 處測定各孔(A)值，表示MDA含量及SOD活性。

DCFH-DA熒光探針檢測細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，各組Müller細胞給藥處理48 h后，加入終濃度10 mmol/L DCFH-DA，放入37 ℃培養箱孵育20 min，使其與細胞充分接觸，后用無血清培養基洗滌3次，調節488 nm激發波長，Cytation5觀察細胞內熒光表達強度，放大倍數20倍。同一實驗平行重復3次。

JC-1法檢測線粒體膜電位(MMP)，各組Müller細胞重懸后接種于24孔培養板中，待細胞貼壁后按照各組要求處理48 h，之后棄掉培養基，PBS沖洗2次，將含有Jc-1探針的空白培養基(1 μg/mL)加入24孔培養板中，放入37 ℃培養箱孵育20 min ，調節激發波長為488 nm和543 nm，Cytation5觀察細胞內熒光表達強度。

檢測線粒體膜通透性轉換孔(mPTP)開放水平，各組Müller細胞重懸后接種于24孔培養板中，待細胞貼壁后按照各組要求處理48 h，之后棄掉培養基，PBS沖洗2次。按照檢測試劑盒分別加入適當體積染色工作液，放入37 ℃培養箱避光孵育40 min。之后更換成新鮮的37 ℃預熱的培養基，再次放入37 ℃培養箱避光孵育30 min，之后棄掉培養基，PBS沖洗3次，最后加入檢測緩沖液，調節激發波長為488 nm，Cytation5觀察細胞線mPTP開放水平。

1.5 免疫熒光檢測IL-1、IL-6、TNF-α炎癥因子表達

各組Müller細胞給藥處理48 h后，PBS沖洗3次；4%多聚甲醛固定25 min，PBS沖洗3次；0.1%TritonX-100通透細胞30 min，PBS沖洗3次；0.1%BSA。

室溫封閉60 min。加入IL-1、IL-6、TNF-α抗體(1∶500)4 ℃過夜，取出后室溫復溫放置60 min，PBS沖洗3次，加入二抗anti-mouse,488-conjugated，fluor 647-conjugated anti-rabbit(1∶500)室溫放置2 h，PBS避光沖洗3次，最后用含DAPI染色劑封片。Cytation5觀察細胞內IL-1、IL-6、TNF-α熒光表達水平并拍照。

1.6 qPCR 法檢測各組細胞中IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達

各組Müller細胞給藥處理48 h后，Trizol法提取細胞總RNA，測定總RNA濃度，逆轉錄合成cDNA，PCR擴增，配制20 μL擴增反應體系。PCR設置反應條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、 55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，30個循環。每個組別設置3個復孔。擴增完畢后，采用2-△△Ct 法計算IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的相對表達量。引物序列如下：

表1 qPCR所用引物系列

1.7 免疫印跡法測定IL-1、IL-6、TNF-α、 p-Akt、p-GSK3β蛋白表達

各組Müller細胞給藥處理48 h后，進行相應蛋白測定。RIPA細胞裂解液提取各組細胞全蛋白，經BCA法測定蛋白質含量，取蛋白樣20 μg與上樣緩沖液混合后100 ℃煮沸10 min，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質,濕轉法轉移至硝酸纖維素膜上，5% BSA封閉，放入一抗IL-1、IL-6、TNF-α、 p-Akt、p-GSK3β(1∶1000)4 ℃雜交過夜。將硝酸纖維素膜經TBST沖洗3次后放入二抗(1∶5000)孵育1～2 h。沖洗后吸去多余液體，增強化學發光法檢測，化學發光凝膠系統分析儀成像,以β-actin作為內參，Image J軟件分析條帶灰度值，計算相對表達量。

1.8 統計學方法

2 結 果

2.1 漆黃素對高糖誘導 Müller細胞增殖活力的影響

CCK8結果顯示，與對照組相比，100 μmol/L漆黃素降低細胞增殖活力(P<0.05)，100 μmol/L以下是安全劑量范圍，見圖1(a)；與對照組相比，100 mmol/L葡萄糖可明顯降低細胞增殖活力(P<0.01)，見圖1(b)；本研究選用100 mmol/L葡萄糖進行后續實驗。與HG組比較，25、50 μmol/L的漆黃素對高糖誘導Müller細胞增殖活力沒有作用(P>0.05)；75 μmol/L漆黃素能夠抑制高糖誘導后Müller細胞增殖活力降低(P<0.05)；而100 μmol/L的漆黃素組反而降低Müller細胞增殖活力(P<0.05)，見圖1(c)。以上結果提示75 μmol/L漆黃素能夠抑制高糖誘導后Müller細胞增殖活力下降。

**P<0.01 vs Control，## P<0.01vs HG

2.2 漆黃素對高糖誘導Müller細胞氧化應激水平的影響

2.2.1 漆黃素對高糖誘導Müller細胞MDA及SOD含量的影響

丙二醛(MDA)含量是反映機體抗氧化能力的參數，以及體內脂質過氧化的程度，從而間接的反映出機體組織及細胞過氧化損傷的程度。超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內一種重要的抗氧化酶，其活性可反應出機體抗氧化能力。實驗各組細胞MDA和SOD水平比較，結果顯示HG組MDA含量明顯高于與對照組，SOD活性明顯低于對照組(P<0.05)，漆黃素組MDA含量明顯低于HG組，SOD活性明顯高于HG組(P<0.05)，TCBN組MDA含量明顯高于漆黃素組，SOD活性明顯低于漆黃素組(P<0.05)，見圖2。

**P<0.01vs Control，##P<0.01vs HG，&& P<0.01vs FIS

2.2.2 漆黃素對高糖誘導Müller細胞ROS水平的影響

ROS參與氧化應激反應，病理條件下ROS的產生和清除失去了正常平衡，ROS 濃度持續升高或持續時間過長會引起蛋白質損傷和脂質過氧化反應等，產生細胞毒性。結果顯示，HG組ROS熒光強度明顯高于與對照組,漆黃素組ROS熒光強度明顯低于HG組，TCBN組ROS熒光強度明顯高于漆黃素組，見圖3。

(a)：熒光圖(20×)；(b)：平均光密度分析

2.2.3 漆黃素對高糖誘導Müller細胞mPTP的影響

mPTP開放導致線粒體損傷及細胞凋亡，綠色熒光越強，說明mPTP開放程度越低，相反綠色熒光越弱，開放程度越高。結果顯示，HG組mPTP綠色熒光強度明顯低于對照組,漆黃素組mTPT綠紅色熒光強度明顯高于HG組，TCBN組mPTP綠色熒光強度明顯低于漆黃素組，見圖4。

(a)：熒光圖(20×)；(b)：平均光密度分析

2.2.4 漆黃素對高糖誘導Müller細胞MMP水平的影響

MMP的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。當MMP較高時，JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物，產生紅色熒光；當MMP較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質中，此時JC-1為單體，產生綠色熒光。結果顯示，HG組紅色熒光強度低于對照組，而綠色熒光強度明顯高于與對照組，漆黃素組紅色熒光強度高于HG組，綠色熒光強度明顯低于HG組，TCBN組紅色熒光強度低于漆黃素組，綠色熒光強度明顯高于漆黃素組，見圖5。以上結果提示漆黃素通過降低高糖誘導Müller細胞MDA含量、抑制ROS產生、穩定MMP、抑制MPTP開放及增加SOD活性來抑制氧化應激反應，而這種作用能被Akt抑制劑TCBN所阻斷，我們推測漆黃素可能通過Akt/GSK3β信號通路發揮抗氧化作用。

2.3 漆黃素對高糖誘導的Müller細胞IL-1、IL-6、TNF-α炎癥因子水平表達的影響

免疫熒光結果顯示，HG組Müller細胞IL-1、IL-6、TNF-α熒光表達強度明顯高于對照組；漆黃素組各炎癥因子熒光強度比HG組明顯減弱；TCBN組各炎癥因子熒光強度比漆黃素組增強，見圖6。

(a～c)：熒光圖(20×)；(d～f)：IL-1β、IL-6、TNF-α平均光密度分析

qPCR和Western Blot結果顯示，HG組IL-1、IL-6、TNF-α mRNA及蛋白表達比對照組明顯增加(P<0.05)；漆黃素組各炎癥因子mRNA及蛋白表達比HG組明顯降低(P<0.05)；TCBN組各炎癥因子mRNA及蛋白比漆黃素組明顯表達增加(P<0.05)，見圖7。以上結果提示漆黃素能夠減少高糖誘導誘導Müller細胞炎癥因子表達水平，而這種作用能被Akt抑制劑TCBN所阻斷。

(a)：各組細胞IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達；(b～c)：各組細胞IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達及半定量分析

2.4 漆黃素對高糖誘導Müller細胞p-Akt、p-GSK3β蛋白水平表達的影響

Western Blot結果顯示，HG組p-Akt、p-GSK3β蛋白表達明顯低于對照組(P<0.05)；漆黃素組p-Akt、p-GSK3β蛋白表達明顯高于HG組增加(P<0.05)；TCBN組p-Akt、p-GSK3β蛋白表達較漆黃素組明顯減少(P<0.05)，見圖8。以上結果提示漆黃素可能通過激活Akt/GSK3β信號通路發揮抗氧抗炎作用，而這種作用能被Akt抑制劑TCBN所阻斷。

(a)：各組細胞p-Akt、p-GSK3β蛋白表達；(b)：各組細胞p-Akt、p-GSK3β半定量分析

3 討 論

慢性炎癥和氧化應激是DR發病重要因素，其特征是血管和視網膜神經元變性[11]。高血糖能引起體內細胞ROS產生增多，當過度ROS的產生與內源性抗氧化因子清除ROS的能力不平衡時，就會發生氧化應激，其特征是ROS誘導的促炎因子和促血管生成因子的過表達，這些因子會損傷神經膠質細胞和神經元，造成組織細胞結構或功能障礙，進而影響整個視網膜[12]。因Müller細胞貫穿于視網膜全層，且與DR發病密切相關，所以本研究選用高糖刺激Müller細胞做為體外模型來研究漆黃素在高糖環境下對Müller細胞的作用，結果顯示，高糖刺激后Müller細胞MDA含量大幅度增加，SOD活性明顯下降及產生大量ROS，說明高糖刺激后Müller細胞處于氧化應激狀態，ROS量升高超出機體的清除能力,導致細胞內線粒體膜系統受到損傷。

mPTP是跨越線粒體內外膜的通道，是由蛋白質組成的復合體，當線粒體內Ca2+超載、過度氧化應激，ROS的大量產生時會導致mPTP呈不可逆性高水平開放，導致線粒體腫脹，線粒體跨膜電位降低，釋放促凋亡因子及抑制BCL-2抗凋亡因子的產生，誘導細胞凋亡[13]。有研究報道天麻素抑制氧化應激時心肌細胞mPTP開放，穩定MMP，從而發揮抗氧化作用保護心肌細胞[14]。本研究發現高糖損傷后ROS大量產生，導致mPTP開放，而漆黃素干預后抑制Müller細胞ROS的產生，進而抑制mPTP開放，隨后應用JC-1染色觀察MMP，發現高糖組mPTP開放時可以導致MMP顯著下降，漆黃素干預后可有效的抑制mPTP開放，維持MMP相對穩定，與文獻報道相一致。炎癥-免疫反應也是近幾年來DR治療的熱點，越來越多的證據表明炎癥是DR發生的關鍵因素。Müller細胞參與構成血-視網膜屏障，也是IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的主要來源。糖尿病狀態下激活NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子，導致Müller細胞發生活化，活化的細胞胞體肥大腫脹，肥大的胞體及突觸進入已閉合血管內形成瘢痕，晚期又參與其它血管的生成。因此，早期干預Müller細胞抑制其活化很有必要。有文獻報道TNF-α促進活化的Müller細胞的膠質細胞增生和炎癥反應，從而加重青光眼RGC的損傷[15]。另有研究報道非增殖型DR患者眼部組織中各種炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和MCP-1水平升高，激活的膠質細胞，內皮細胞產生的這些細胞因子的增加，突出了這些炎癥細胞因子在DR早期的活性增加，這些炎癥介質的積累是糖尿病患者視網膜神經元細胞的早期死亡的原因之一?，F階段臨床上使用非甾體類抗炎藥如阿司匹林來治療DR，臨床效果穩定且良好，這也從臨床方面證實了炎癥反應在DR發病中的作用。本研究結果顯示高糖刺激后IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子表達增多，漆黃素處理后表達顯著下降，與文獻報道相一致。

Akt/GSK-3β信號通路在細胞生長、存活、細胞凋亡及信號轉導中發揮重要作用，Akt是絲氨酸/蘇氨酸激酶，可通過抑制凋亡信號從而保護細胞免于凋亡，糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)是活化的Ser/Thr 蛋白激酶，可調節糖原代謝和細胞凋亡[16]。已有文獻報道，激活Akt 信號通路可保護氧化應激損傷導致的小鼠原代神經元凋亡；提高磷酸化 GSK 3β(Ser9)，從而保護線粒體免受鐵誘導的氧化應激[17]。本研究結果顯示漆黃素能夠抑制高糖刺激Müller細胞氧化應激反應及炎癥因子表達，增加p-Akt及p-GSK 3β蛋白表達。而加入Akt抑制劑TCBN后結果顯示漆黃素的抗氧化應激及抗炎作用被阻斷，p-Akt及p-GSK 3β蛋白表達下降，所以我們推測漆黃素是通過激活Akt/GSK 3β發揮作用。

綜上所述，在高糖刺激氧化應激損傷模型中，漆黃素通過降低細胞內MDA含量、增加SOD活性、抑制ROS產生、mTPT開放來維持MMP穩定，減少炎癥因子表達從而減輕氧化應激損傷，這種作用與激活Akt/GSK 3β信號通路有關。但漆黃素對高糖刺激后氧化應激和炎癥與線粒體深入機制還需深入研究。