基于網絡藥理學分析北豆根抗阿爾茨海默病的作用機制

孟雪蓮，劉松瑤，薛京蘇

(遼寧大學 藥學院，遼寧 沈陽 110036)

0 引言

老齡化問題已成為全球共性問題，根據中國的人口年齡結構特點，中國社會構成已經符合典型的老齡化社會特點[1].阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是威脅老年人健康和生命的神經系統疾病之一.全球老齡化問題的加劇，也導致了AD發病率的顯著上升.AD的主要臨床表現癥狀為記憶和認知功能損傷，其主要的病理特征為Aβ斑塊在大腦皮質、海馬等部位的堆積以及神經元中神經原纖維纏結(NFTs)的形成，進一步可引起神經元的損害和死亡[2-6].AD的發病機制復雜多樣，目前應用于臨床的藥物均以延緩疾病進程為主，尚無能終止疾病發展的藥物[7].

中醫在中國已經發展了兩千余年，因其獨特的魅力，近年來受到了廣泛關注.與西藥不同，中藥是通過多靶點多途徑復合干預，實現對疾病的治療，不同途徑間也可能存在相互影響，以實現對系統和機體的整體調控[8-9].網絡藥理學是一門新興學科，它從系統層面揭示藥物對機體的整體調控作用，通過特定的數據分析方法尋找不同藥效成分的作用靶點和通路，闡釋藥物對疾病的干預的過程，實現了傳統中藥研究與現代藥理學研究的緊密聯系.網絡藥理學的出現使得新藥研發從“一個基因、一種藥物、一個疾病”為主導的傳統模式轉變為“網絡靶向、多組分療法”的新模式[10-12].

北豆根是防己科植物蝙蝠葛(Menispermum dauricum DC.)的干燥根莖，原名蝙蝠葛根，性寒涼，具有清熱、解毒、祛風、止痛的功效，對多種炎癥具有治療作用[13-14].北豆根中活性成分眾多，其中生物堿類成分含量為1.7%～2.5%，由于其結構的多樣性和生物活性的廣泛性成為研究的重點[15].北豆根常見的藥理作用有抑菌、抗心律失常、降壓、抗腫瘤、抗炎等[16-20]，近年來有文獻報道，北豆根主要成分蝙蝠葛堿具有抗AD作用[21-23].

本研究建立了針對北豆根活性成分抗AD的網絡藥理學分析方法，尋找其潛在作用靶點和作用通路，通過相關方法分析其可能的作用機制，研究結果具有一定的理論和實際意義.

1 實驗方法

1.1 數據庫的構建

1.1.1 構建北豆根主要活性成分的相關靶點數據庫

在TCMSP數據平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，https：//www.tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMAN-TCM數據庫(http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)中檢索北豆根的有效化學成分，以生物利用度(OB)、類藥性(DL)和含量作為條件篩選出研究對象.有效化學成分的2D結構下載自PubChem數據庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，將其導入SwissTargetPrediction數據庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)中，選擇人類(Homo sapiens)作為研究物種(下述研究過程均選擇人類為研究物種)，預測得到相關的潛在作用靶點.合并多個化學結構的搜索結果，并去除重復項，輸入到string數據庫(https：//string-db.org/)中，篩選0.95置信區間的靶點，得到北豆根中主要化學成分的相關靶點數據庫.

1.1.2 構建AD疾病靶點相關數據庫

以“Alzheimer′s disease”為檢索詞在GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org/)、OMIM數據庫(https：//omim.org/)中搜索，查找與AD疾病相關的潛在基因靶點.經篩選將疾病靶點輸入到string數據庫中，設置0.95置信區間，得到AD疾病靶點相關數據庫.

1.1.3 構建“藥物成分-疾病”交集靶點數據庫

將1.1.1構建的北豆根主要化學成分相關靶點數據庫和1.1.2構建的AD疾病靶點相關數據庫導入到BioVenn軟件(http：//www.biovenn.nl/index.php)中交互處理，得到“藥物成分-疾病”交集靶點數據庫.

1.2 構建蛋白相互作用(PPI)網絡

將得到的交集靶點導入string數據庫，篩選0.95置信區間，以確保數據的可靠性，得到“藥物成分-疾病”交集靶點之間的相互作用信息.將相互作用信息導入到Cytoscape 3.7.2軟件，進行蛋白靶點間的拓撲分析.

1.3 構建“藥物成分-交集靶點-疾病”網絡

建立藥物成分、交集靶點、AD之間的成分-靶點、靶點-疾病對應關系數據文件和相應的屬性文件，采用Cytoscape 3.7.2軟件來構建“藥物成分-交集靶點-疾病”網絡模型圖，進一步使用Network Analyzer功能進行拓撲參數分析計算.

1.4 基因本體(GO)富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

將“藥物成分-疾病”交集靶點導入到DAVID數據庫(https：//david.ncifcrf.gov/)中，并設置Identifier為OFFICIAL GENE SYMBOL、List Type為Gene List，進行GO富集分析和KEGG通路富集分析.篩選P<0.01的通路為可靠通路，利用OmicShare Tools(https：//www.omicshare.com/tools/home/index/index.html)可視化研究結果.

1.5 構建“藥物成分-交集靶點-作用通路”網絡

篩選KEGG分析中的通路，得到關鍵靶標參與的關鍵通路.建立藥物成分、交集靶點、作用通路、AD之間的成分-靶點、靶點-通路、靶點-疾病對應關系數據文件和相應的屬性文件，利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物成分-交集靶點-作用通路”網絡模型圖，并進行分析.

1.6 分子對接驗證

利用Discovery Studio 2016 Client軟件對得到的北豆根主要活性成分與篩選得到的關鍵靶點蛋白進行分子對接驗證.

2 實驗結果

2.1 數據庫的構建

根據篩選標準得到北豆根中7種主要活性成分(見圖1)，包括蝙蝠葛堿、粉防己堿(雙芐基四氫異喹啉類生物堿)、蝙蝠葛啡諾林堿、蝙蝠葛任堿(阿樸啡類生物堿)、蝙蝠葛辛(氧化異阿樸啡類生物堿)、光千金藤堿(原阿樸啡類生物堿)、青藤堿(嗎啡烷類生物堿).經SwissTargetPrediction數據庫預測和string數據庫篩選得到192個北豆根化學成分相關潛在作用靶點.數據庫檢索AD疾病靶點相關數據庫，經篩選最終得到1 106個相關潛在基因靶點.將兩者導入BioVenn軟件中交互處理，得到92個交集靶點(見圖2).

圖1 北豆根7種主要活性成分

圖2 北豆根7種活性成分相關靶點與阿爾茨海默病相關靶點的交集靶點數

2.2 構建蛋白相互作用(PPI)網絡

將2.1得到的92個交集靶點輸入到string數據庫中，經0.95置信區間篩選，得到85個“藥物成分-疾病”交集靶點之間的相互作用信息(見圖3).結果表明，src酪氨酸蛋白激酶(sarcomatyrosineprotein kinase，SRC)、信號轉導和轉錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)、熱休克蛋白90AA1(heat shock protein 90AA1，HSP90AA1)、磷脂酰肌醇3-激酶調節亞基1(phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunitalpha，PIK3CA)、蛋白激酶Bα(protein kinase Bα，AKT1)等為度值(Degree)較大的靶點蛋白，可能是關鍵靶點.

圖3 “藥物成分-疾病”交集靶點PPI網絡圖

2.3 構建“藥物成分-交集靶點-疾病”網絡

利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物成分-交集靶點-疾病”網絡模型圖(見圖4)，并進行分析.結果涉及93個節點(包括7個化學成分、85個交集靶點和1個疾病)和278條邊，其中脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，SYK)、sigmaR1受體(type 1 sigma receptor，SIGMAR1)、PIK3CA、Janus激酶3(Janus kinase 3，JAK3)、多巴胺D2受體(dopamine receptor D2，DRD2)、集落刺激因子1受體(colony stimulating factor 1 receptor，CSF1R)、AKT1等均為度值較大的靶點蛋白，并能與多個成分相互作用，證明了北豆根中的這7種主要活性成分具有多成分-多靶點共同作用的特點.

2.4 GO富集和KEGG通路富集分析

利用OmicShare Tools進行GO富集分析可視化，設置P<0.01，得到GO功能富集分析圖(見圖5)，涉及53個條目.其中，在生物過程(Biological Process)方面，主要涉及刺激反應(response to stimulus)、細胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)、生物過程的調節(regulation of biological process)等；在細胞組分(Cellular Component)中，主要包括細胞器(organelle)、細胞膜(membrane)等；在分子功能(Molecular Function)方面，主要包括結合(binding)、催化活性(catalytic activity)等.

圖5 GO功能富集分析圖

KEGG通路富集分析得到高級氣泡圖(見圖6).在分析得出的108條潛在作用通路中，具有顯著意義的(P<0.01)有90條.結合相關文獻，篩選出與AD相關的通路有31條，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、紅細胞癌基因B(erythroblastic oncogene B，ErbB)、腫瘤壞死因子、Fc段受體Ⅰ(Fc epsilon receptor Ⅰ，Fcε RI)、低氧誘導因子-1(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)和凋亡等信號通路，取排名前20的通路形成高級氣泡圖.提示北豆根可以通過以上多條通路來發揮治療AD的作用.

圖6 北豆根化學成分抗阿爾茨海默病作用靶點的KEGG富集氣泡圖

2.5 構建“藥物成分-交集靶點-作用通路”網絡

通過KEGG分析，最終得到7個活性成分、69個關鍵核心靶點和31條相關通路.利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物成分-交集靶點-作用通路”網絡模型圖，分析結果如表1所示.結果涉及108個節點(包括7個化學成分、69個交集靶點、31條通路和1個疾病)和668條邊.度值越大表示與之相連的節點越多，即在整個網絡中的調控作用越大.結果表明，度值較大的化學成分有粉防己堿(Tetrandrine，29)、蝙蝠葛啡諾林堿(Dauriporphinoline，26)、蝙蝠葛堿(Dauricine，24)等.度值較大的靶點蛋白有AKT1、PIK3CA、磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基δ(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit delta，PIK3CD)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、PIK3R1等，可能是北豆根干預AD疾病發揮作用的靶點.這些靶點涉及的通路有磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)、大鼠肉瘤(Ras)、黏著斑、端粒結合蛋白(Rap1)等信號通路.其中PI3K-Akt通路涉及的靶點數最多(29個)，該通路可能是北豆根發揮抗AD作用的關鍵通路.

2.6 分子對接驗證

利用Discovery Studio 2016 Client軟件將得到的7個主要活性成分與篩選得到的關鍵靶點蛋白AKT1、PIK3CA、PIK3CD進行分子對接驗證(見表2).LibDockscore代表分子對接的吻合度，分數越高代表配體與受體蛋白結合性越好.結果顯示，篩選出來的北豆根的7個主要活性成分都能與AKT1、PIK3CA、PIK3CD蛋白很好地結合，從而在PI3K-Akt通路上發揮作用.分子對接結果與網絡藥理學篩選結果一致，驗證了其可靠性.圖7—9為分別與3個蛋白結合性最好的化合物的分子對接結果.

表1 “藥物成分-交集靶點-作用通路”網絡分析結果

表2 北豆根主要活性成分與關鍵蛋白的對接結果

圖7 Dauricine-PIK3CD分子對接結果

圖8 Dauricine-PIK3CA分子對接結果

圖9 Dauricine-AKT1分子對接結果

3 分析與討論

本文聚焦當下嚴重影響老年人身心健康的AD，通過網絡藥理學分析，研究了北豆根的主要活性成分對該疾病的潛在作用靶點和作用途徑，進而研究北豆根化學成分干預AD疾病的作用機制.經篩選得到北豆根7種主要活性成分均為生物堿，揭示北豆根發揮抗AD的主要成分為生物堿類成分.預測該7種主要活性成分潛在作用靶點得到192個，其中與AD相關的靶點有92個，即“藥物成分-疾病”交集靶點.構建PPI網絡和“藥物成分-交集靶點-疾病”網絡，結果反映了北豆根主要活性成分與交集靶點在系統水平上的復雜相互作用，表明北豆根干預AD可能是由多種成分調控多個靶點來發揮療效的.GO富集分析結果表明，北豆根干預AD的相關生物過程涉及刺激反應、代謝過程、對生物反應的調控等.通過KEGG通路富集分析和篩選后，顯著作用通路有VEGF、ErbB、TNF、Fc ε RI、HIF-1和凋亡等信號通路，提示北豆根可能通過以上多條通路來發揮防治AD的作用.構建“藥物成分-交集靶點-作用通路”網絡進一步分析，北豆根7個活性成分與69個AD關鍵核心靶點相關，并參與31條AD相關信號通路.結果表明，北豆根可能主要通過PI3K-Akt信號通路來發揮抗AD作用，AKT1、PIK3CA、PIK3CD、PIK3R1、IKBKB、GSK3B等可能為北豆根干預AD疾病的關鍵靶點.

PI3K-Akt通路可以調節細胞的增殖、分化及凋亡等信號轉導通路，可以由多種生物因子激活，引發下游一系列信號級聯反應，逐步發揮特定的生理反應，調節機體狀態[24].Akt是PI3K的重要靶點，能夠調控下游相關蛋白[25-26].核因子κB抑制蛋白激酶β(IKBKB)是核因子κB抑制因子(IκB)激酶，Akt可以將IKBKB磷酸化并使之激活，從而使IκB磷酸化，進而使核轉錄因子核因子κB(NF-κB)與IκB解離開來，恢復其轉錄活性[27].NF-κB會介導炎性細胞因子如一氧化氮合酶(iNOS)、白介素(IL-1β)、白介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子(TNF-α)等的釋放，過度的炎性反應會促使AD的發生和發展[28].GSK3B作為Akt的下游底物，能夠通過NF-κB信號轉導通路增加β-分泌酶(BACE1)介導APP蛋白的剪切，從而增加Aβ的生成和沉積[29]；GSK-3β也可以作用于Tau蛋白，經GSK-3β作用后，Tau蛋白可發生過度磷酸化，進而導致神經元中NFTs形成并發生細胞凋亡，該生理過程最終將表現出一系列AD的經典癥狀[30]；同時也能通過調節凋亡蛋白家族Bcl-2等來實現對神經細胞凋亡的調控[31].因此研究PI3K/Akt/GSK-3β信號轉導通路具有重要意義，其與AD的高度相關性成為了深入了解AD的成因及拓展AD治療新方法新思路的關鍵.

結合PPI和“藥物成分-交集靶點-疾病”網絡分析結果，SRC、STAT3、HSP90AA1、SIGMAR1、DRD2、JAK3均可能是北豆根中活性成分干預AD的關鍵靶點蛋白，Ras、Rap1、叉頭轉錄因子(FoxO)、MAPK和TNF等信號通路都可能是其發揮藥效的關鍵通路.表明北豆根干預AD的作用是多成分多靶點綜合調控，多信號通路聯合作用的結果.

本文的研究結果表明了北豆根干預AD主要通過7種活性成分(蝙蝠葛堿、青藤堿、蝙蝠葛辛、光千金藤堿、蝙蝠葛任堿、蝙蝠葛啡諾林堿、粉防己堿)作用于AKT1、PIK3CA、PIK3CD、PIK3R1等關鍵靶點蛋白介導PI3K-Akt等信號通路來發揮作用，揭示了北豆根多成分-多靶點-多通路抗AD的作用特點.本研究運用網絡藥理學方法初步預測了北豆根治療AD潛在的作用機制，其詳細機制仍需進一步的實驗驗證.本研究可為北豆根及其活性成分抗AD的體內外作用機制研究提供思路.