白茶寡肽的抗氧化活性研究

王小娟，劉 慧，王良瑄，吳文晞，趙 峰*

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建恒正檢測技術有限公司，福建 福州 350199；3.福建省中藥資源重點實驗室，福建 福州 350122）

白茶屬于微發酵茶，是中國六大茶類之一，其不經殺青與揉捻，具有外形芽毫完整，滿身披毫，滋味清甜回甘等特點。白茶主產于福建福鼎、政和、松溪等地［1］，可分為白毫銀針、白牡丹、壽眉、貢眉四個品類［2］。白茶的藥性價值好，具有解酒醒酒、清熱潤肺、平肝益血、消炎解毒、降壓減脂、消除疲勞等功效［3］。

目前對于白茶功效性成分研究多集中于茶多酚，咖啡堿以及多糖等物質。寡肽是一種小分子量的蛋白質，是由2～10個氨基酸連接而成，分子量在2000 Da以內?，F代研究表明，寡肽具有易吸收的特點，而且不同氨基酸序列的寡肽具備潛在的抗氧化、降血壓、降血糖、降血脂、免疫調節等作用［4-8］。近年的研究顯示，白茶加工過程中長時間的萎凋有利于茶葉蛋白質的降解和寡肽的富集［9］。最新的研究顯示，白茶中寡肽含量達6%～8%，超過游離氨基酸總量，高于其他參試茶類（紅茶、綠茶、黃茶和烏龍茶）［9,10］。但目前尚未見任何對白茶寡肽活性的實驗性研究。本研究旨在通過白茶寡肽的制備、測序和抗氧化活性研究，進一步了解白茶寡肽對白茶保健功效貢獻的作用，以期為寡肽活性的進一步研究奠定基礎，也為將來相關功能性產品的開發提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白茶（一級白牡丹，福建政和，2021年5月產，購自福州水木年茶文化傳播有限公司）；無水乙醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、叔丁基過氧化氫（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；3,5-二硝基水楊酸、Western及IP細胞裂解液（分析純，上海源葉生物技術有限公司）；DMEM高糖培養基［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；胎牛血清［依科賽生物科技（太倉）有限公司］；0.25%胰酶、雙抗（博士德生物工程有限公司）；蛋白濃度（BCA）測定試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（南京建成生物研究工程所）；正戊烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀、二甲基亞砜（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）。

電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HY-2漩渦混勻儀（上海儀分科學儀器有限公司）；P5型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；電熱恒溫培養箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；BHS系列水浴鍋（寧波群安實驗儀器有限公司）；分液漏斗振蕩器（上海佳邦電子有限公司）；CO2培養箱［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；多功能微孔板酶標儀［帝肯（上海）貿易有限公司］；FD-1C-50型冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；FlowMem0021-HP三聯高壓平板膜（廈門福美科技有限公司）。

1.2 白茶寡肽制備

參照 MATHIAS S［11］和劉慧［12］的方法，制備白茶寡肽。具體步驟如下：白茶粉碎后，以300 mL正戊烷分5次浸泡脫脂，300 mL無水乙醇分5次回流提?。ò被峒肮央目扇苡谝掖?，而多糖、高分子量水溶性蛋白質則不溶），合并提取液，濾液40℃下真空旋蒸后，以100 mL純水轉溶，再依次分別使用二氯甲烷，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丁酯進行液液萃?。糠N溶劑萃取5次，每次200 mL），取水相，40℃下旋蒸去除殘余有機溶劑后，冷凍干燥，以500 Da超濾膜濃縮后，取截留物（即＞500 Da）凍干后得白茶寡肽，-20℃保存。

1.3 白茶寡肽純度檢驗

定量測定白茶寡肽中茶多酚、咖啡堿、游離氨基酸總量和總糖，檢驗其純度。具體步驟為：稱取10 mg白茶寡肽，超純水溶解后定容至100 mL；取適量，按照GB/T 8313-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》、GB/T 8312-2013《茶 咖啡堿測定》、GB/T 8314-2013《茶 游離氨基酸總量的測定》和3,5-二硝基水楊酸（DNS）［13］比色法測定總糖。

1.4 白茶寡肽高通量測序

按照ZHAO F等的方法［9,10］對寡肽進行測序。

前處理方法：稱取白茶寡肽0.1 g（精確到0.001 g）于50 mL離心管，加入15 mL 50%（v/v）甲醇，渦旋，放入70℃水浴鍋中15 min，取出，冷卻至室溫，過0.22 μm濾膜，使用Q-Exactive超高壓液相色譜-四極軌道超高分辨質譜（Thermo Scientific，USA）鑒定白茶寡肽中的肽段種類。

液相色譜條件：Acquity UPLC CSH C18柱（內徑2.1×100 mm，粒徑1.7 μm）；流動相由流動相A［Milli-Q水（含0.2%甲酸）］和流動B［乙腈（含0.2%甲酸）］組成；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：30℃；樣品進樣量：10.0 μL；洗脫梯度為：0-5 min 98%A；5-30 min 98%A→ 80%A，30-60 min 80%A→20%A，60-90 min 20%A→5%A，90-95 min 5%A 和 95.1-105 min 98%A。

質譜條件：正離子模式；MS/top10 dd-ms2；一級質譜分辨率70000；二級質譜分辨率，17500；噴霧電壓3.50 kv；毛細管溫度320℃；輔助氣體加熱器溫度411℃；鞘層氣體流速（N2）40 L·h-1；輔助氣體流速（N2）15 L·h-1。

質譜數據由Xcalibur 2.2 SP2 軟件（Thermo Scientific，USA）采集；寡肽序列拼接，由蛋白質組學軟件Peaks Studio 8.5（Bioinformatics Solutions,Canada）通過一級母離子精確分子量及對應二級碎片的a離子，b離子，y離子等的解析完成；茶樹蛋白質數據庫：Tea tree protein.fasta［14］；一級母離子允許偏差，15 ppm；二級碎片離子允許偏差，0.02 Da；肽段篩選，按照ALC（平均置信度）分值≥90且-10logP≥20。

1.5 鑒定肽段活性預測及溶解性評估

根據文獻［15］，按照表1標準對所鑒定寡肽活性的抗氧化活性進行評分預測。使用網站工具（http://www.chinapeptides.com/tool.aspx）檢索所鑒定肽段的親水殘基占比和平均親水性，從而評估其溶解性。

表1 抗氧化活性預測評分規則Table 1 Guidelines for scoring predicted antioxidant activity

1.6 體外抗氧化能力評價

1.6.1 DPPH自由基清除能力

參照鄭景如等［16,17］以及劉慧等［17］的方法并略作改進，在室溫條件下，向96孔板中逐一加100 μL 0.6 mmol·L-1的DPPH甲醇溶液后，再分別加入100 μL樣液，100 μL甲醇，100 μL DPPH溶液，混勻后，在暗處反應30 min，于517 nm波長下測定吸光度（A）。以還原性谷胱甘肽溶液（同等濃度）做對照、純水作空白，根據公式（1）計算DPPH自由基清除能力，根據公式（2）計算樣品的抗氧化能力（AO值）。每個樣品重復3次，結果取平均值。

注：IC50（樣品）為樣品的半抑制濃度（半數清除率）；IC50（谷胱甘肽）為谷胱甘肽的半抑制濃度。

1.6.2 羥自由基清除能力

參照XU Y等［18］的方法并略作改進，在10 mL試管中依次加入1 mL 6 mmol·L-1FeSO4溶液、1 mL不同濃度的樣品溶液、1 mL 6 mmol·L-1H2O2溶液，啟動反應，于室溫中靜置10 min，再加入1 mL 6 mmol·L-1水楊酸溶液作為捕獲劑，室溫靜置30 min，取200 μL上清液于96孔板中，用酶標儀在510 nm波長下測定吸光度。陽性對照組用還原性谷胱甘肽（同等濃度）代替樣品，空白組用超純水代替H2O2，對照組用水代替樣品，根據公式測定清除羥自由基能力。每個樣品重復3次，結果取平均值。

1.6.3 總還原力

參照LU C等［19］的方法并略作改進，在10 mL離心管中依次加入0.5 mL不同濃度的樣品溶液，0.5 mL磷酸緩沖溶液（0.2 mol·L-1，pH 6.6），2.5 mL 1%的鐵氰化鉀，于50℃水浴20 min，再加入0.5 mL 10%的三氯乙酸，3000 r·min-1離心10 min。取100 μL上清液與70 μL超純水以及70 μL 0.1%三氯化鐵于96孔板中，室溫反應10 min，用酶標儀在700 nm波長下測定吸光度。陽性對照組用還原性谷胱甘肽（同等濃度）代替樣品，空白組用超純水代替樣品，根據公式測定總還原力。每個樣品重復3次，結果取平均值。

總還原力＝A樣品-A空白

1.7 細胞抗氧化能力評價

1.7.1 細胞培養

將HepG2細胞于37℃恒溫水浴鍋中進行復蘇，加入一定量的培養基（DMEM高糖培養基＋10%胎牛血清＋1%雙抗），1200 r·m-1離心3 min，隨后將細胞轉移至25 cm2培養瓶內，于37℃、5%CO2細胞培養箱中進行培養，待細胞貼壁生長至80%～90%時，以1∶3進行傳代。

1.7.2 細胞毒性實驗

參照張燕［20］等方法并略作改進，將處于對數生長期的HepG2細胞接種于96孔板中，每個孔內細胞數約5×104個，向每孔中加入100 μL培養基，在37℃、5% CO2條件下培養24 h，向每孔中加入100 μL用培養基配制的不同濃度的白茶寡肽溶液，每組設置6個復孔，培養24 h后，向每孔加入100 μL濃度為1 mg·mL-1的噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）溶液，培養4 h，吸出MTT溶液，向每孔加入200 μL DMSO溶液，震蕩10 min，在490 nm波長下測定吸光度，空白組不加細胞，對照組用培養基替代樣品，重復以上操作，并按照以下公式測定細胞存活率：

1.7.3 氧化應激細胞模型的建立

參照CHANG X［21］等的方法并略作修改，選擇不同濃度的H2O2對于HepG2細胞處理4 h，以細胞存活率為指標，選擇細胞存活率為60%的H2O2濃度作為誘導條件，細胞存活率采用MTT測定法。

1.7.4 HepG2細胞中SOD活性的測定

參照SOD試劑盒說明書，向上述的96孔板中加入一定量的細胞裂解液，用微量移液器吸出待測。另取一96孔板，分別加入20 μL待測樣本，20 μL酶工作液以及200 μL底物應用液?；靹?，37℃孵育20 min，450 nm處酶標儀測定。對照組用蒸餾水代替待測樣本，對照空白組用蒸餾水代替待測樣本，酶稀釋液代替酶工作液，每個樣品重復3次，結果取平均值。

1.8 數據分析

實驗數據結果以平均值±標準差（x±SD）表示，采用Excel 2019和SPSS 25.0對實驗數據進行差異顯著性分析及單因素方法分析，以Origin 2021進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 白茶寡肽純度

白茶寡肽的得率為3%，純度檢驗結果顯示，茶多酚含量＜0.9 mg·g-1，咖啡堿含量＜1.5 mg·g-1，游離氨基酸含量＜1.5 mg·g-1，總糖未檢出（DNS法的檢出限為2.0 mg·g-1）。即，白茶寡肽中茶多酚、咖啡堿、游離氨基酸以及總糖的殘留量均小于0.2%。

2.2 白茶寡肽測序及活性預測

根據肽段鑒別標準［平均局部置信區間（ALC≥90）及-10logP≥20］，從白茶寡肽中共鑒別到44條肽段，其對應的質譜信號強度、親水殘基占比、平均親水性和抗氧化力預測值如表2所示。結果可知，上述寡肽中疏水性基團的占比較高，特別是亮氨酸（L）和異亮氨酸（I）的占比較高，表明其潛在較強的抗氧化能力［22,23］。此外，已知規律顯示，當氨基酸序列中含有天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、酪氨酸（Y）以及甘氨酸（G）時，肽鏈會具有突出的抗氧化潛力。表2的評分結果顯示，經篩選的白茶寡肽氨基酸序列的抗氧化活性評分多處于4.5～5.5分，其中抗氧化評分最高的氨基酸序列為LLILLIIII，為7.5分。

表2 白茶寡肽序列質譜信號強度、親水殘基占比、平均親水性和抗氧化力預測值Table 2 Relevant information on identification of white tea oligopeptides

注：1親水殘基比例指多肽序列中親水性氨基酸殘基數占總殘基數的百分比。2平均親水性是根據多肽序列中各氨基酸殘基以及不同修飾的親/疏水值來得到的。從一條肽的平均親水性值，可以判斷其在水的溶解性如何。

2.3 白茶寡肽鏈長以及分子量分布

對全部鑒定到的寡肽的鏈長和分子量分布區間進行統計，由圖1可知，全部44條肽中最短的肽為四肽，最長的肽為十三肽。從肽段的數量和占比上看，以四肽最多，共12條，占比28.6%；其次為九肽，共9條，占比21.4%。從分子量分區區間看，所提取的白茶寡肽多集中于300～500 Da區間，其次為900～1100 Da區間。

圖1 鑒定肽段構成特征分析Fig. 1 Characterization of identified peptides

2.4 白茶寡肽的體外抗氧化能力評價

2.4.1 DPPH自由基清除能力

DPPH在無水乙醇中呈深紫色，當DPPH自由基被清除，其最大吸收波長517 nm處的吸光值隨之減小，可以評價供試樣品提供電子對能力的強弱，進而表征其抗氧化能力［19］。由圖2可知，在0～0.5 mg·mL-1的測試濃度范圍內，其對自由基的清除能力呈快速直線上升，至0.5 mg·mL-1時為最高（達91.86%），之后隨濃度增加，清除率未見明顯改變。

圖2 白茶寡肽對DPPH自由基的清除能力Fig. 2 DPPH free radical scavenging ability of white tea oligopeptides

白茶寡肽的IC50為0.170 mg·mL-1，谷胱甘肽的IC50為0.126 mg·mL-1，即，白茶寡肽的DPPH自由基清除能力基本接近于谷胱甘肽。根據GB/T 39100-2020《多肽抗氧化性測定 DPPH和ABTS法》計算白茶寡肽AO值，得出白茶寡肽的AO值為1.350。

2.4.2 羥自由基清除能力

羥自由基是人體在形成代謝過程中產生最活潑、危害最大的自由基之一，可使氨基酸、蛋白質、核酸等物質遭受氧化性損傷和破壞，進而導致細胞損傷［24］。圖3顯示，在試驗濃度范圍內，白茶寡肽的羥自由基清除能力平穩上升，呈現濃度依賴性。當寡肽粗提物濃度達到1.2 mg·mL-1時，其羥自由基清除能力為54.93%。計算后可知，白茶寡肽的羥自由基清除能力的IC50為0.850 mg·mL-1，而谷胱甘肽的羥自由基清除能力的IC50為1.816 mg·mL-1，說明白茶寡肽的羥自由基清除活性遠超谷胱甘肽。

圖3 白茶寡肽對羥自由基的清除能力Fig. 3 Hydroxyl radical scavenging ability of white tea oligopeptides

2.4.3 總還原力

還原力的大小可以表示抗氧化物質供給電子的能力，還原能力大的樣品就是很好的電子供體。通過提供電子可使自由基轉變為穩定的物質，進而可中斷自由基的連鎖反應［25］。利用鐵氰化鉀還原法測定白茶寡肽的總還原力，且還原力與吸光度成正相關，即吸光度越大，白茶寡肽總還原力越強，抗氧化能力也越強。由圖4得知，在試驗濃度范圍內，白茶寡肽的總還原力呈現一定的增長趨勢，當濃度為500 μg·mL-1時，吸光度最大（達1.033），總還原力最強，表明其抗氧化能力也最強。

圖4 白茶寡肽的總還原力Fig. 4 Total reducing power of white tea oligopeptides

2.5 白茶寡肽在細胞水平的抗氧化能力評價

2.5.1 白茶寡肽作用于HepG2細胞的濃度篩選

由圖5可知，白茶寡肽濃度為100～1000 μg·mL-1范圍時，HepG2細胞的存活率呈現了先下降再上升最后下降的趨勢。白茶寡肽濃度為100～800 μg·mL-1的范圍內，HepG2細胞存活率均大于80%，說明白茶寡肽濃度在100～800 μg·mL-1范圍內對細胞無明顯毒性。當白茶寡肽濃度為1000 μg·mL-1時，細胞存活率為74.47%，細胞增長受到明顯抑制。因此選用白茶寡肽濃度為100、300、500 μg·mL-1進行后續試驗。

圖5 不同濃度白茶寡肽對HepG2細胞的毒性作用Fig. 5 Toxicity of white tea oligopeptides in varied concentrations on HepG2 cells

2.5.2 HepG2氧化應激細胞模型的建立

由圖6可知，隨著H2O2濃度的不斷上升，細胞存活率總體趨勢是不斷下降的（P＜0.05）。在一般細胞模型的藥物篩選中，選擇細胞存活率為50%～70%的濃度為誘導濃度。當H2O2的濃度為500 μmol·L-1時，細胞存活率為61.37%。與對照組相比，當H2O2的濃度為600 μmol·L-1時，細胞存活率僅為40.98%（P＜0.01），存活率顯著下降，H2O2濃度太高可能會對細胞產生不可逆損傷，因此確定以500 μmol·L-1為誘導濃度，開展后續試驗。

圖6 不同濃度H2O2對HepG2細胞存活率的影響Fig. 6 Effects of hydrogen peroxide in varied concentrations on viability of HepG2 cells

2.5.3 白茶寡肽對HepG2氧化應激模型的保護作用

圖7所示是不同濃度白茶寡肽處理后的HepG2細胞形態，從形態角度可以直觀地觀察到H2O2損傷及寡肽的保護作用。具體地看，圖7-B中正常組細胞呈梭形狀，排布均一；而圖7-A中模型組細胞形態變圓，細胞間隙變大且有部分細胞脫落；圖7-C為白茶寡肽100 μg·mL-1給藥組，與模型組相比，其細胞形態幾乎一致，但其細胞間隙變小，且無細胞脫落現象，表明低濃度白茶寡肽，未能對H2O2誘導HepG2氧化應激細胞模型產生明顯保護。圖7-D、7-E分別為白茶寡肽300 μg·mL-1和500 μg·mL-1的給藥組，與模型組比較發現，細胞形態逐漸變為梭形，排布也逐漸緊密，表明上述濃度的寡肽，開始對H2O2誘導HepG2氧化應激細胞模型產生明顯的保護。

圖7 不同濃度白茶寡肽處理經H2O2誘導的HepG2細胞形態Fig. 7 Morphology of HepG2 cells induced by H2O2 and treated with white tea oligopeptides in varied concentrations

SOD是生物體系中抗氧化酶的重要組成部分，其可保護細胞、機體免受氧化損傷。因此，本研究還測定了細胞體系的SOD酶活性（圖8）?？芍?，與正常組相比，模型組的SOD活力顯著降低（P＜0.05）。即，細胞在500 μg·mL-1H2O2處理下發生了氧化損傷。但隨后，伴隨白茶寡肽給藥濃度的增加，細胞內的SOD活力也開始上升；當寡肽濃度為300、500 μg·mL-1時，與模型組相比，其抗氧化水平呈現顯著性差異（P＜0.05），且與正常組相比，已不存在顯著性差異（P＞0.05）。表明白茶寡肽對H2O2誘導的HepG2氧化應激細胞模型具有保護作用，且呈現濃度依賴性。

圖8 不同濃度白茶寡肽對H2O2誘導的HepG2細胞中SOD的影響Fig. 8 Effects of white tea oligopeptides in varied concentrations on SOD activity of H2O2-induced HepG2 cells

3 討論與結論

近年來，白茶因其有助于人體健康的特性受到人們的關注。最近的研究表明［26,27］，白茶具有獨特的抗氧化活性，飲用白茶可以減輕氧化應激作用。本研究通過分析白茶寡肽的氨基酸序列發現，白茶寡肽的氨基酸排布會影響白茶寡肽的抗氧化活性，疏水性氨基酸以及酸性氨基酸能增強白茶寡肽的抗氧化能力。并且通過體外抗氧化評價實驗，發現白茶寡肽的抗氧化能力總體呈現濃度依賴性。

ZHAO F［10］等研究了白茶萎凋過程中寡肽的變化，發現白茶長時萎凋有助于寡肽的富集，且鑒定的白茶寡肽多集中于短肽。分子量小的寡肽因為本身性質使其更易被人體所吸收，能夠直接參與人體代謝活動［28］。白茶寡肽構成以低分子量為主，表明其潛在的優異抗氧化能力。本研究結果表明，白茶寡肽有著顯著的抗氧化能力，擁有較強的DPPH自由基清除率以及羥自由基清除率，總還原能力實驗也表明了白茶寡肽具有優良的抗氧化能力，并且通過細胞實驗也驗證了白茶寡肽的抗氧化能力。

肽的結構特性、電子分布、氫鍵等分子特征都可能影響到肽段的抗氧化活性［29］。GIMENEZ B［30］等報道了酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）可以通過金屬螯合能力進而增強肽的抗氧化能力。ZHU Z［31］等報道了甘氨酸因其側鏈擁有一個氫離子，可以與金屬產生螯合作用，所以可能在抗氧化活性方面發揮著至關重要的作用。TSOPMO A［32］等報道了酪氨酸結構中含有芳香環以及額外的-OH，有助于其與金屬離子的螯合作用以及增強自由基清除能力，可能使酪氨酸擁有較強的抗氧化能力。FENG L［33］等研究表明當酪氨酸位于肽鏈中的C-端或N-端時，酪氨酸能夠通過從酚基團中提供一個氫原子，從而使擁有酪氨酸的肽鏈表現出較強的抗氧化能力。本研究結果表明，從白茶寡肽中鑒定出的氨基酸序列中存在天冬氨酸、酪氨酸以及甘氨酸時，肽鏈的抗氧化能力會增強，推測白茶寡肽的抗氧化能力與其氨基酸序列有著密切的關系。未來可從白茶寡肽的氨基酸構成層面上，進一步研究白茶寡肽的抗氧化能力。

本研究首次成功制備了白茶寡肽，通過高分辨質譜探究了白茶寡肽的構成氨基酸序列，并進一步通過DPPH自由基清除實驗、羥自由基清除實驗、總還原力實驗和HepG2細胞氧化應激保護能力實驗，揭示白茶寡肽具備優異的抗氧化能力。上述研究結果將有助于我們從寡肽構成的角度進一步了解白茶活性的物質基礎，進而推動白茶醫藥和功能性產品的開發。