N6-甲基腺苷甲基轉移酶樣蛋白3在乳腺癌發生發展中的作用

吳華濤，崔玉坤

（1.汕頭大學醫學院第一附屬醫院普外科，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院廣東省乳腺癌診治研究重點實驗室，廣東 汕頭 515041）

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）最早于20世紀70 年代由Desrosiers 等[1]團隊報道，是真核信使RNA（messenger RNA，mRNA）中最豐富的內部修飾方式。近年來，針對m6A修飾的研究越來越廣泛，m6A主要出現在序列RRm6ACH（[G/A/U][G＞A]m6AC[U＞A＞C]）中，該甲基化修飾過程是可逆性的，包括甲基轉移酶、去甲基化酶和甲基化閱讀蛋白等共同參與[2]。越來越多的證據表明，m6A不僅在正常的生理過程中發揮重要作用，在多種惡性腫瘤的發生發展過程中都占據重要地位[3]。

目前研究表明m6A修飾過程在乳腺癌發生發展中發揮著重要的作用，有望成為腫瘤治療的新靶點[4]。其中甲基轉移酶樣蛋白3（methyltransferase-like protein 3，METTL3）作為主要的m6A甲基化酶，通過調控下游分子甲基化水平參與正常生理和多種疾病的病理過程，且多項研究顯示METTL3在人類多種惡性腫瘤中表達失調且具有致癌/促癌特性[3]。本文將總結METTL3 在乳腺癌發生發展中作用的最新研究進展，探索其對乳腺癌的調控機制及其作為乳腺癌患者治療靶點的潛能。

1 參與m6A修飾的分子及其作用

研究已經證實，m6A對RNA的甲基化修飾是可逆化過程，調控因子包括甲基轉移酶、去甲基化酶和甲基化閱讀蛋白等[5]。結構生物學研究表明，甲基轉移酶METTL3 和METTL14 均具有關鍵的催化結構域，在m6A 修飾過程中，兩者之間形成復合物，共同行使催化功能，其中METTL3 具有催化活性，而METTL14 主要負責底物識別，因此METTL3表達水平及活性對真核生物細胞內m6A修飾水平起到重要的作用。Huang等[6]指出，m6A相關修飾酶在腫瘤中的表達水平不盡相同，環境因素和基因位點突變均可導致m6A狀態的改變，同時m6A修飾還可參與腫瘤靶向治療基因的調控。因此，METTL3 在惡性腫瘤的發生發展中占有重要的地位。

2 METTL3分子在乳腺癌中的表達情況

Zhang 等[7]首先在乳腺癌干細胞（breast cancer stem cell，BSCS）中發現，在缺氧刺激下缺氧誘導因子可促進m6A 去甲基化酶ALKBH5 的表達，進而使多能性因子NANOG 的甲基化水平下調、表達增加并誘導BSCS 表型，而ALKBH5 表達的下調可顯著減少BSCS 的數量，降低乳腺癌發生的能力，提示m6A甲基化水平對乳腺癌發生發展的重要作用，而m6A甲基轉移酶METTL3的表達水平則可直接影響乳腺癌中m6A 的修飾水平。有趣的是，沉默METTL3 表達可抑制乳腺癌細胞的增殖能力，并增強其凋亡水平[8]。隨后，Fry 等[9]在永生化的人類乳腺上皮細胞HMEC 中發現METTL3 表達及m6A 水平均下調，過表達METTL3可促進該細胞的增殖和遷移潛能。Wu等[10]利用生存分析及Cox 單因素分析發現METTL3 表達水平與乳腺癌患者不良預后密切相關；且另一項研究發現在乳腺癌組織及細胞中，METTL3的表達均顯著升高[11]。

然而，一項針對轉移率和惡性程度高的三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer， TNBC） 的研究則發現 ，METTL3在TNBC中呈低表達狀態，且與TNBC患者短距離無轉移生存率密切相關，敲除METTL3 可通過降低TNBC細胞中的m6A 水平進而增強細胞的遷移、侵襲和黏附能力[12]。Fry 等[9]則發現在永生化和轉化的乳腺上皮細胞中，METTL3的表達及m6A甲基化水平均顯著低于其親本細胞。

3 METTL3調控乳腺癌的分子機制

3.1 METTL3促進乳腺癌增殖、抑制凋亡

失控性增長是惡性腫瘤重要的生物學特點之一，乳腺癌也不例外。研究認為在脊椎動物細胞凋亡過程中，線粒體處于凋亡調控的中心位置，而在線粒體通路中，凋亡信號激活含BH3 結構域的Bcl-2 家族成員，后者發生寡聚化并插入線粒體膜，引起線粒體膜通透性改變，誘導細胞凋亡[13]。Wang 等[11]發現抗凋亡蛋白 Bcl-2 是 METTL3 的下游靶分子。在乳腺癌細胞和組織中，METTL3 表達水平顯著增高，敲減METTL3 表達可下調Bcl-2 的m6A 及表達水平，進而促進腫瘤細胞凋亡，抑制其增殖能力。Cheng等[14]在探索二甲雙胍對乳腺癌的治療作用的研究中，通過轉錄組測序發現p21是METTL3的潛在下游分子，METTL3可以通過依賴m6A的方式抑制p21的表達，從而促進乳腺癌細胞增殖；而二甲雙胍則以p21為主要靶點，通過抑制METTL3 的表達降低乳腺癌細胞中m6A 水平，進而上調p21 表達，抑制乳腺癌細胞的增殖，提示METTL3 是二甲雙胍治療乳腺癌的潛在靶點。

METTL3 通過m6A 修飾不僅可以調控下游蛋白表達，還可以通過調控非編碼RNA的表達水平調控后者的下游蛋白，進而影響乳腺癌發生發展過程。乙型肝炎X互作蛋白（hepatitis B X-interacting protein，HBXIP）的異常表達是驅動乳腺癌侵襲性進展的重要因素，Cai 等[8]研究發現HBXIP 可通過抑制小分子miRNA let-7g 進而上調METTL3的表達，而上調的METTL3則可通過上調HBXIP的m6A修飾水平，進而促進HBXIP的表達，兩者正反饋調控，最終促進了乳腺癌的增殖并抑制了凋亡的發生。Rong等[15]發現長 鏈 非 編 碼 RNA （long non-coding RNA， lncRNA）LINC00958 是METTL3 的下游分子，m6A 甲基轉移酶METTL3 通過促進LINC00958 甲基化水平上調后者的表達，而LINC00958則在乳腺癌增殖進展過程中扮演促癌基因的作用，其通過吸附作用降低miR-378a-3p的表達，從而上調其下游基因YY1的mRNA 和蛋白水平，促進乳腺癌的增殖能力。而LINC00675 在METTL3 甲基化的修飾下則增強了其作為內源性競爭RNA 的作用，增強了其與miR-513b-5p 的相互作用，進一步抑制了miR-513b-5p 對下游基因的抑制作用，從而抑制了乳腺癌細胞的增殖能力和侵襲轉移能力[16]。

近期，Wan 等[17]研究發現，在乳腺癌細胞中，PD-L1是METTL3 介導的m6A 修飾的下游靶點，抑制METTL3 表達可顯著下調m6A修飾水平，降低PD-L1的穩定性，進而增強PD-L1介導的T細胞激活和浸潤，在體增強抗腫瘤免疫，對腫瘤免疫治療提供了新的治療策略和思路。

3.2 METTL3促進乳腺癌轉移

作為體表腫瘤，乳腺癌患者因癌死亡的主要原因是腫瘤的復發和遠處轉移，探索乳腺癌復發和轉移的分子機制，將為延長患者生存期和提高患者生存質量提供幫助。Chen 等[18]篩選建立了乳腺癌肺轉移細胞模型，即BCLMF3細胞，并進一步研究發現在BCLMF3細胞中m6A 甲基化水平及METTL3 的表達均顯著升高，而去甲基化酶FTO 明顯下調；METTL3通過甲基化角蛋白7（keratin 7，KRT7）的反義lncRNA KRT7-AS 的A877 位點，促進KRT7-AS/KRT7 mRNA 的穩定性及KRT7 的翻譯和表達；體內實驗和臨床研究都同樣證實METTL3 及其上調的KRT7 和KRT7-AS 均在乳腺癌肺轉移過程中發揮重要作用，是治療乳腺癌轉移的重要靶點。LncRNA 轉移相關肺腺癌轉錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1，MALAT1）也是METTL3甲基化的下游分子[19]。METTL3通過上調MALAT1 的m6A 修飾水平進而增加MALAT1 的表達，而MALAT1則可通過吸附miR-26b進而上調其下游分子高遷移率基團AT-Hook 蛋白2 （high mobility group at-hook protein 2，HGMA2），從而促進乳腺癌上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程和侵襲轉移能力[19]。

另一方面，Li 等[20]則發現METTL3基因在乳腺癌中高表達環狀circMETTL3，其作為內源性競爭性RNA 拮抗miR-31-5p的作用，進而上調其下游靶分子周期蛋白依賴性激酶1 促進乳腺癌侵襲轉移，而其宿主基因METTL3則可通過m6A 依賴的方式上調circMETTL3 的表達，促進乳腺癌進展；該研究未發現circMETTL3 對其宿主基因表達的影響。然而，近期一項針對TNBC 的研究則認為circMETTL3 可作為miR-34c-3p 的吸附海綿進而促進其下游分子METTL3的表達，發揮抑制細胞增殖、侵襲和腫瘤生長轉移的作用[21]。而免疫共沉淀研究發現，METTL3 可與EZH2 的mRNA 結合，并通過m6A 修飾促進后者的表達，進而通過下調E-cadherin 的表達促進乳腺癌細胞的EMT和轉移過程，加重乳腺癌的進展[22]。

3.3 METTL3促進乳腺癌耐藥

雌激素受體陽性的Luminal 型乳腺癌患者對含他莫昔芬等藥物的內分泌治療敏感，預后優于其他類型的乳腺癌患者。然而，他莫昔芬耐藥的出現嚴重影響了患者生存期和生存質量，Liu等[23]發現在他莫昔芬耐藥的乳腺癌細胞株中腺苷酸激酶4（adenylate kinase 4，AK4）和METTL4 表達均顯著上調。研究表明，在他莫昔芬耐藥的MCF-7乳腺癌細胞株中AK4的5′非翻譯區存在多個m6A修飾位點，在METTL3 調控下，AK4 表達顯著上調并進一步激活活性氧自由基的產生及p38的磷酸化水平，從而誘導乳腺癌細胞產生對他莫昔芬的抗性。

而METTL3 的高表達同樣可以降低乳腺癌對阿霉素（adriamycin，ADR）的敏感性，研究表明，在ADR耐藥的MCF-7 乳腺癌細胞中下調METTL3 表達可降低pri-miR-221-3p 的m6A 甲基化水平，從而抑制后者的成熟，降低miR-221-3p 及多藥耐藥蛋白1 和乳腺癌耐藥蛋白的表達；另一方面，miR-221-3p 可通過與3′非翻譯區結合負向調控同源結構域相互作用蛋白激酶2 （homeodomaininteracting protein kinase 2，HIPK2），進而誘導 ADR 耐藥的MCF-7 乳腺癌細胞的抗性。METTL3/miR-221-3p/HIPK2信號軸的發現闡述了乳腺癌化療耐藥的表觀遺傳學分子機制，并提供了新的治療靶點[24]。而Li 等[25]也發現MALAT1 作為METTL3 的下游分子同樣參與了乳腺癌對ADR 耐藥的過程，METTL3 甲基化修飾MALAT1 并上調后者的表達，進而招募轉錄因子E2F1 直接結合于人前梯度蛋白2（anterior gradient 2，AGR2）的啟動子區域促進AGR2 的表達，誘導乳腺癌細胞對ADR 治療的抵抗。METTL3 同樣參與了同源重組修復的調控，抑制METTL3表達可降低同源重組修復的效率，并通過調節EGF/RAD51軸的m6A 修飾水平增加ADR 所誘導的DNA 損傷[26]。上述結果均提示，METTL3 介導的化療藥物反應性改變，是惡性腫瘤治療的重要分子機制。

3.4 METTL3促進乳腺癌腫瘤干細胞特性

腫瘤干細胞理論的提出為重新認識腫瘤的起源和本質提供了新的方向，也為臨床惡性腫瘤的治療提供了新的視角[27]，而對腫瘤干細胞標志物的篩選為該類研究提供了有力的平臺[28]。Xie 等[29]研究表明，METTL3 在乳腺癌組織中高表達，同時與腫瘤大小和淋巴結轉移密切相關，而敲減METTL3 的表達可顯著下調腫瘤干細胞標志物SOX2、CD133 和CD44 的表達水平，進一步抑制乳腺癌的侵襲轉移能力，而RNA 免疫共沉淀實驗證實SOX2 是METTL3 的靶分子，METTL3 可與SOX2 的mRNA 直接結合并富集SOX2的表達。

NANOG 是維持干細胞自我更新增殖和亞全能性的關鍵因子，屬于胚胎干細胞的轉錄因子，可增強腫瘤干細胞的多能干性，增加了惡性腫瘤的復發風險[30]。而METTL3作為轉錄因子鋅指蛋白217 （zinc finger protein 217，ZNF217）的下游分子可以抑制NANOG的表達，ZNF217通過下調METTL3 及m6A 水平促進NANOG 的表達，促進乳腺癌細胞的干性和進展[31]。

4 總結與展望

近期，He 等[32]利用TCGA 數據庫，在775 例乳腺癌患者中分析了24 種與m6A 修飾相關的重要調節因子的表達情況，發現m6A調節因子與乳腺癌惡性程度、預后及抗腫瘤免疫反應等密切相關，提示m6A修飾在乳腺癌發生發展過程中起到重要的作用。而不同類型的惡性腫瘤中m6A甲基轉移酶METTL3 的高表達均與患者不良預后密切相關，是腫瘤進展過程中的重要標志物[33]。本文通過對已發表的關于甲基轉移酶METTL3 在乳腺癌中的作用分析后發現，METTL3主要通過提高乳腺癌細胞內m6A修飾水平調控下游蛋白或非編碼RNA的表達水平，進而影響乳腺癌的發生發展過程。然而，由于表觀遺傳學中RNA 翻譯的復雜性，現有的研究結果對METTL3在乳腺癌進展中的作用仍存在一定的爭議，對METTL3的作用及其調節乳腺癌的關鍵步驟和分子機制仍需進一步研究和闡明。

雖然針對METTL3 作用的研究存在一定矛盾的結果，但其在乳腺癌中發揮促癌作用得到一定的認可，且以METTL3或m6A修飾為分子診療靶點的研究展現出了相應的效果，為患者帶來希望，受到了廣泛的關注[34]。此外，除了上述已報道的在乳腺癌中的作用機制外，METTL3 也在其他重要的生物過程起到重要的作用，如新陳代謝調節、血管生成失調、免疫逃逸等[35]。因此，深入研究并闡明METTL3及其調控的m6A修飾對明確乳腺癌發生發展的機制，完善相關分子調控網絡，探索乳腺癌精準治療的潛在靶點等均具有重要的意義。同時迫切需要研發針對METTL3的抑制劑或小分子藥物，將為研究m6A修飾表型與乳腺癌表型間的關系提供條件，也使其在未來成功地應用于乳腺癌患者的治療提供了可能。