哺乳動物合子基因組激活過程中的染色質重塑

張景瑤，張 魯，高 帥

(中國農業大學動物科學技術學院，北京 100193)

哺乳動物早期胚胎發育過程中，合子基因組激活(zygotic genome activation，ZGA)異常會導致胚胎發育阻滯和妊娠失敗，是造成動物早期胚胎丟失的重要原因。在ZGA期間，胚胎轉錄模式發生巨大轉變的同時也伴隨著劇烈的表觀遺傳重編程，包括染色質高級結構、染色質可及性(chromatin accessibility)、DNA甲基化在內的表觀遺傳信息的廣泛變化，其正在重構胚胎表觀基因組[1-2]。隨著高通量測序技術的發展，研究人員可以在單細胞和單堿基的分辨率下，從全基因組水平研究哺乳動物早期胚胎發育過程中表觀遺傳信息的動態變化和作用機制。因此，研究ZGA過程中發生的染色質重塑能夠加深對早期胚胎發育的了解，對于解決胚胎體外培養過程中早期胚胎發育阻滯、難以發育至囊胚期的難題，改善胚胎體外培養效率具有重要意義。

1 合子基因組激活

胚胎發育早期，合子基因組在一定時間內保持沉默，由卵母細胞所提供的mRNA和蛋白質調控發育的初始階段，這種調控稱為母體效應(maternal effect)。而在受精卵分裂到一定時期，隨著胚胎的不斷發育，母源蛋白質和mRNA逐漸被消耗降解[3]，合子基因組被激活并表達，胚胎發育由母體效應控制轉變為胚胎自身的基因組控制。初始階段由母體提供的基因產物指導母源mRNA的降解，而后期合子產生的蛋白質和microRNA能夠提高母源mRNA的降解效率[4-6]。母源到合子的過渡(maternal-to-zygotic transition，MZT)對發育至關重要，其可協調細胞分裂和ZGA，為細胞分化和進一步發育做好準備。ZGA是哺乳動物植入前胚胎發育過程中發生的最明顯的轉錄變化之一，正是在這一發育階段，動物細胞開始獲得不同的命運和特定的形態。在大多數哺乳動物中，基因組的激活是逐步進行的，ZGA過程一般由兩個階段組成：第一個階段是最早轉錄活動的起始期，又稱為次要的合子基因激活期(minor ZGA)，此時某些合子基因已經開始轉錄；另一個階段是主要的合子基因激活期(major ZGA)[7-8]。在小鼠早期胚胎發育過程中，minor ZGA起始于1-細胞中晚期，主要轉錄一些重復序列和沒有正常PolyA加尾和剪切的低水平轉錄本[9-10]。用RNA聚合酶Ⅱ的可逆抑制劑暫時抑制minor ZGA會導致胚胎發育停滯在2-細胞階段[11]。小鼠胚胎內major ZGA發生在2-細胞晚期，表現為大量基因的正常激活[12]。Graf等[13]發現，在牛胚胎體外培養過程中，最大比例的基因激活發生在8-細胞期，而在4-細胞前的發育過程中，僅有少量胚胎基因表達。且ZGA發生的時間具有物種特異性，除小鼠以外，在大多數哺乳動物胚胎中major ZGA發生在第2～3次卵裂后[14-15](表1)。ZGA過程中，胚胎基因組從幾乎沒有轉錄的狀態轉變為數千個基因被轉錄的狀態，這與其他發育轉變有很大的區別。在其他發育轉變過程中，細胞的整體轉錄水平在很大程度上保持穩定，少數轉錄因子足以通過激活部分基因來指示細胞沿特定譜系發育的命運。

表1 不同哺乳動物主要合子基因組激活發生時期

2 染色質重塑

真核生物體內，染色質重塑通過改變核小體位置和結構調控染色質結構，并通過允許或阻止關鍵調控序列與轉錄因子結合，進而激活或抑制特定基因在不同發育時期的轉錄，從而實現一系列表觀遺傳層面的變化。

2.1 染色質高級結構

在真核生物中，染色質不以線性分子的形式存在，而是經過復雜而有序的折疊，分層包裝在細胞核內。染色質高級結構是表觀遺傳非常重要的組成部分，在配子發生與早期胚胎發育的調控過程中發揮著非常重要的作用，能夠廣泛參與DNA復制、DNA修復、細胞分裂分化和轉錄調控等過程[16-17]。染色質高級結構可以分為染色質環(loop)、拓撲關聯域(topologically associating domain，TAD)、A/B區室(A/B compartment)和染色體領地(chromosome territory，CT)等多個層級[18-22](圖1)。Lieberman-Aiden等[19]利用高通量全基因組染色質構象捕獲 (high input chromosome conformation capture，Hi-C)技術研究了人類基因組的三維結構，首次提出可以將染色質區域明確分成兩個部分，稱之為A/B compartment。A compartment包含的基因較多，mRNA表達量相對較高，染色質可及性較高，富集激活性修飾H3K36me3，對應開放染色質區域；而另一些區域包含的基因個數較少，轉錄活性也低，稱為B compartment，對應封閉染色質區域。TAD結構是指染色質上一段連續的區域，此區域內的所有位點之間相互作用頻率很高，但與區域外位點相互作用極少，一般認為TAD結構是染色體空間構象基本的結構單元[20]。loop是指由cohesion蛋白介導并與DNA上的CTCF結合，錨定形成的環狀結構，loop錨定區域常富含啟動子、增強子和沉默子等調控元件[22]。 多梳蛋白相關結構域(polycomb associating domains，PAD)是小鼠初級卵母細胞中特殊的染色體三維結構。研究人員利用少量細胞全基因組染色質構象捕獲(sisHi-C)技術系統檢測了小鼠卵子發生各個時期以及早期胚胎發育過程中的染色體結構，發現伴隨著卵泡的發育，完全生長的初級卵母細胞(full-grown oocytes，FGOs)出現了非經典的特殊染色體三維結構[23]，經典的區室結構明顯減弱或消失[23-24]，與此同時在近端區域出現了新的區室結構，并與由多梳抑制復合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)催化的抑制性組蛋白修飾H3K27me3標記區域高度吻合。這一結構在初級卵母細胞發生生發泡破裂(germinal vesicle break down，GVBD)時迅速消失，受精后又特異性地出現在早期胚胎的母本基因組中[23]。近年的研究結果表明，染色質的結構是高度動態的，其高級結構經常由于各種染色質重塑復合體的修飾而改變[25]，染色質的空間結構對于真核生物不同時期生命活動的正常有序進行有重要調控作用。

圖1 染色質高級結構[22]Fig.1 The higher-order chromatin structure[22]

2.2 染色質可及性

染色質可及性是指核內大分子與染色質化的DNA物理接觸的難易程度，由是否被核小體占據、染色質拓撲結構及其他染色質結合因子決定。核小體間DNA通常與轉錄因子、RNA聚合酶或帶有連接組蛋白(linker histone)的結構蛋白結合，從而調節染色質高級結構和局部染色質可及性。雖然可接近(accessible)的染色質僅占總基因組序列2%～3%的區域，但卻含有90%以上的轉錄因子結合位點。核小體和連接組蛋白占位率在基因組范圍內呈動態變化，構建了高度動態的染色質可及性圖譜，這對于染色質的結構和功能至關重要，反映了生物的調控能力[26]。染色質可及性通過調節DNA結合蛋白的基因組可及性調控基因在不同時期的表達，研究發現，開放染色質標志著如啟動子、增強子和絕緣子等調控元件與細胞內特定轉錄因子相互作用，精細調控下游基因的轉錄活性，從而確定了賦予細胞身份和功能的細胞特異性基因表達模式，指導細胞的發育和凋亡[27-28]。

2.3 染色質重塑常用研究方法

近年來，隨著單細胞及微量細胞基因組測序技術的高速發展，使得研究早期胚胎表觀遺傳動態變化成為可能。Hi-C技術通過將空間結構鄰近的DNA片段進行交聯，并富集交聯的DNA片段進行高通量測序，解析全基因組范圍內染色質片段間的相互作用。通過改進Hi-C方法，研究人員僅需要少量細胞就能夠從全基因組水平了解哺乳動物早期胚胎發育中的染色質高級結構的動態變化規律[29]。而目前人們主要利用DNase-seq、ATAC-seq及COOL-seq這幾種技術研究染色質可及性。DNase-seq技術利用DNase Ⅰ內切酶切割無核小體包裝的裸露DNA，對酶切下來的DNA小片段建庫測序，得到DNase Ⅰ超敏位點DHS[30]；ATAC-seq技術利用Tn5轉座酶不能進入核小體連接致密的地方，但能進入松散的區域并切割下暴露的DNA[31]；COOL-seq技術則是利用M.CviP Ⅰ甲基化酶在體外對細胞核進行甲基化，進而通過檢測GCH(GCA/GCC/GCT)位點甲基化水平表示染色質可及性。其中，COOL-seq技術實現了在單細胞分辨率上對細胞進行轉錄組、基因組甲基化及染色質開放狀態等多層次的分析，具有很高的靈敏性，能夠準確檢測出染色質的開放狀態，并能夠將染色質關閉狀態與假陰性相區分。據報道，COOL-seq技術在小鼠附植前胚胎單細胞全基因組的平均覆蓋率為12.5%，將單細胞數據合并時覆蓋率可以達到77.6%[32]，高于ATAC-seq等方法獲得的數據。

3 ZGA過程中發生的染色質重塑

在ZGA前，胚胎表觀基因組呈現出十分特殊的狀態，其特征包括缺乏異染色質或存在不成熟的異染色質狀態、非轉錄依賴的激活性修飾廣泛建立，高度松散的染色質高級結構及非轉錄依賴的開放染色質廣泛出現[33]。受精卵在胚胎發育早期經歷了一系列的染色質重編程事件，事實上，在哺乳動物胚胎植入前發育過程中，染色質重塑對于表觀遺傳重編程及消除配子特異性信號以將終末分化的配子轉化為全能狀態至關重要[34]。

3.1 染色質高級結構在ZGA過程中的動態變化

在小鼠的受精卵中，三維染色質結構大部分缺失，并在植入前發育過程中逐漸建立，這促進了后期胚胎中染色質的遠距離相互作用。受精后，合子基因組發生整體去甲基化和抑制性組蛋白的減少，與松弛染色質相關的表觀遺傳因子在小鼠受精卵中更為豐富，而與染色質壓縮有關的因子在ZGA期間變得更加普遍，表明在ZGA前胚胎中的染色質結構更為松散[35]。一般而言，小鼠早期胚胎的染色質結構的特征在于染色質高度分散[36-37]，不存在異染色質結構域和TAD結構域[38-39]，組蛋白乙?；胶腿旧|遷移率較高[40-41]；而且幾乎所有物種中，受精后染色質都處于高度松散的狀態，這種高度松散的染色質狀態為母源轉錄提供了獨特的調控環境，這對于支持major ZGA發生前的卵裂期胚胎發育至關重要。實際上，去除小鼠受精卵內組蛋白H3K9和H3K4去甲基化酶LSD1會導致異染色質過早形成，從而干擾了發育進程，導致胚胎發育阻滯在2-細胞階段[38]。最近的研究結果表明，這種高度松散的染色質結構有可能與ZGA的某些關鍵基因(如Zscan4)的表達相關[35]，但這種松散的染色質結構是否是卵裂期胚胎保持全能性所必需的還有待進一步探索。

染色質結構重塑的機制在不同物種中有所不同。如小鼠胚胎中TAD的建立取決于DNA復制，而人類胚胎中TAD的建立需要ZGA[39,42]。此外，在小鼠初級卵母細胞中，TAD和loop結構較弱，沒有經典的區室結構，但是出現了特殊的PAD結構域[36]。 而第二次減數分裂中期(metaphase Ⅱ，MⅡ)，卵母細胞因處于減數分裂中期而呈現均一的染色質構象，缺乏TAD、PAD和區室結構[23,39]。 相比之下，小鼠精子既存在TAD，又存在區室結構[36]，且精子基因組還存在頻繁的超長程相互作用(>4 Mb)和染色體間相互作用[43]。受精后，小鼠胚胎中父母本的染色質高級結構均迅速解聚，合子染色質處于一種高度松散的狀態，但父母本的染色質高級結構在空間上彼此分離并顯示出明顯的區室化，這種等位基因的分離和區室化會一直保持到8-細胞階段[44]。與小鼠不同的是，由于染色質調控因子CTCF的表達水平下調，人類精子缺乏TAD。但在人類胚胎發育過程中，染色質高級結構在ZGA前同樣極其松散，且TAD和A/B區室也是逐漸建立的(圖2)[45]。

圖2 植入前胚胎發育過程中的動態染色質高級結構[45]Fig.2 Dynamic chromatin structures during preimplantation embryo development[45]

Li等[46]利用Hi-C技術研究豬胚胎植入前發育過程的染色質結構變化發現，相較于小鼠，在豬的早期胚胎中>10 Mb的區室結構域(即超級結構域)更為普遍。TAD和A/B區室結構等染色質高級結構在豬胚胎植入前發育過程中逐漸建立，尤其是ZGA之后，且建立的模式與小鼠相似。值得注意的是，在豬的孤雌與孤雄胚胎早期發育過程中染色質高級結構建立的模式與體外受精(IVF)胚胎十分不同，尤其是在ZGA過程中，這些胚胎出現了強烈的去區室化，且TAD建立的速度也要慢得多，這可能是導致豬胚胎發育阻滯的原因。

3.2 染色質可及性在ZGA過程中的動態變化

染色質介導的轉錄抑制狀態可能有助于選擇性地調節胚胎內啟動子活性，在確保正常時空發育的同時抑制非必需基因的表達[12]。對小鼠早期胚胎發育研究發現，小鼠胚胎染色質可及性在合子期相較于配子顯著增加，在合子后期降低，然后在2-～4-細胞期再次增強[32]。 而Wu等[47]利用ATAC-seq技術研究表明，小鼠早期胚胎發育過程中染色質可及性逐漸增強，且早期胚胎的啟動子和轉錄終止位點染色質可及性都較高。除此之外，在minor ZGA時期，MuERV-L等促進ZGA特異性基因表達的重復序列有很強的轉錄活性和染色質可及性[9,47-48]。與小鼠不同的是，在人類早期胚胎發育過程中，受精卵染色質可及性低于卵子，而胚胎染色質可及性從合子期開始降低，直到8-細胞階段后再次增強，且從胚胎合子期開始父本基因組的染色質比母本基因組的染色質更加開放，這種狀態一直維持到4-細胞期[49]。Oct4和Sox2的結合基序在人ZGA階段開放的染色質區域上明顯富集，而在小鼠ZGA時期并不富集。敲低Oct4后，約25%的人ZGA基因表達下調，而小鼠的ZGA基因基本不受影響[50-51]。

人和小鼠早期胚胎發育過程中的染色質可及性變化也存在一些共同點。研究發現，人2-細胞期胚胎中存在廣泛的開放染色質區域，這些區域富集在富含CpG的啟動子區域，而這種啟動子區的提前開放可能與未來的ZGA相關。某些遠端非啟動子區染色質可及性也較強，然而這些開放染色質區域隨著ZGA的發生會大量消失，胚胎細胞在新的調控元件上建立開放染色質區域；1-～4-細胞期胚胎遠端開放染色質區域傾向于出現在母本基因組特異的DNA低甲基化區域[52]。在小鼠早期胚胎中，開放染色質也常出現在大片低甲基化的部分甲基化區域(partially methylated domain，PMD)[53]，并常帶有參與抑制轉錄的特殊組蛋白修飾H3K4me3(呈非經典的寬峰形式)。這些非經典的修飾很多位于基因間區和遠端區域，在ZGA后，這種非經典H3K4me3修飾被擦除并建立經典模式[54]，同時伴隨著遠端PMD區域染色質的關閉，而在增強子區域重建開放染色質區域，但啟動子區域的開放染色質被保留[53]。研究人員提出，這種早期胚胎基因組激活前特有的開放染色質區域可能作為一種特殊的染色質海灣暫時儲存轉錄因子，而在ZGA過程中這些位點被關閉，轉錄因子可以釋放至啟動子區域參與ZGA[52]。這種在人和小鼠胚胎發育中保守的染色質可及性變化規律對于早期胚胎的基因組沉默以及隨后發生的ZGA都具有重要作用。

對牛胚胎體外培養過程染色質可及性變化的研究發現，早在2-細胞期，部分開放染色質區域就已經出現并一直持續到桑椹胚時期。實際上，在2-和4-細胞期，持續的開放染色質區域比階段特異性的開放染色質區域更頻繁地出現在基因組，這些持續的開放染色質區域富集CTCF結合位點，可能為major ZGA提供了穩定的染色質高級結構；而在8-細胞期胚胎中，開放染色質富集在與發育控制相關的同源盒(homeobox)基因轉錄位點。因此，在早期胚胎發育過程中，母體和胚胎因素共同為major ZGA建立合適的染色質開放狀態。除此之外，通過比較不同物種胚胎植入前發育過程中開放染色質變化發現，與小鼠相比，牛和人的ZGA模式更加相似[55]。對牛體內胚胎植入前發育過程中染色質可及性特征的研究也發現，2-和4-細胞期胚胎的染色質可及性處于較低的水平，而在8-細胞期，即major ZGA發生期間顯著增加[56]。

4 展 望

在早期胚胎發育過程中，隨著ZGA的發生，染色質結構總體上變得更加緊湊，能夠將DNA結合蛋白限制在開放染色質區域，而局部染色質可及性的增加促進了轉錄因子(小鼠胚胎中為Dppa2、Dppa4、Nfy、Dux，人胚胎中為Oct4、Dux4)與DNA相結合，允許特定基因的轉錄[4,50,57-60]。因此，染色質高級結構的動態變化和染色質可及性的局部改變共同為合子基因組的激活與表達做好準備。哺乳動物早期胚胎發育過程中表觀遺傳發生了劇烈的變化，染色質重塑是重要的表現形式，且其他表觀遺傳修飾的重編程與染色質重塑過程密切相關。早期胚胎發育過程中的表觀遺傳重編程是一個精確調控的過程，在轉錄因子特異性調控下，大多數表觀遺傳標記發生重建。近年來，由于單細胞高通量測序技術的發展，對植入前胚胎發育過程中發生的表觀遺傳變化有了更深的理解，已經發現不同的轉錄因子在表觀遺傳模式轉換中發揮著重要作用，但仍有很多問題目前尚未解決。如目前并不清楚在基因組不同位置上轉錄因子如何調控表觀遺傳重編程，以及這些表觀遺傳修飾如何影響基因轉錄調控。而細胞命運的轉變需要多種表觀遺傳的協同調控，因此，研究哺乳動物ZGA過程中染色質重塑將為了解細胞命運轉變和精準調控早期胚胎發育提供新的理論依據。相關機制的揭示可為開發減少ZGA異常、保障哺乳動物早期胚胎正常發育的技術措施提供依據。