微液液提取-氣相色譜-串聯質譜聯用檢測葡萄酒9種農藥殘留

黨富民，李自芹，劉長勇，唐宗貴，楊濤，趙志永★

（1新疆農墾科學院分析測試中心，新疆 石河子 832000；2新疆農墾科學院農產品加工研究所，新疆 石河子 832000）

葡萄酒是新鮮葡萄或葡萄汁經發酵而成的飲料，適量飲用還能預防多種疾病，增強體質[1-2]。但是在葡萄生產過程中，大量殺蟲劑[3-4]、殺菌劑[5-6]和除草劑[7]等農藥噴施會殘留在葡萄及葡萄酒中。人長期進食后，就會在體內積累，引起慢性中毒[8-10]。由于葡萄酒產地廣泛，各地區使用農藥種類不一，加上復配農藥的大量使用，使得葡萄酒中農藥殘留由單一種類向多種方向發展。為保證葡萄酒產品的食用安全，提高我國食品安全監管水平[11-12]，保障公民身體健康，促進葡萄酒產業的發展，研究一種準確、快速、靈敏的葡萄酒中農藥殘留檢測方法是非常必要的。

目前，國內外酒類農藥殘留前處理方法主要有液液萃取法[13-14]、固相萃取法[15-16]、固相微萃取法[17]等，但這些前處理方法繁瑣、成本高，有毒有害化學試劑用量大[18-20]，對環境造成污染大。本文研究了微液液提?。∕LLE）技術作為樣品前處理方法，使樣品前處理簡單快捷，省去大量有毒試劑，節約成本，利于環保，適用于液體樣品的分析。通過基質匹配標準校正方法補償基質效應，靈敏度和準確度均滿足農殘分析要求，方法可用于葡萄酒中農藥殘留的快速檢測。

1 試驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

7890B/7000C氣相色譜串聯質譜聯用儀（美國安捷倫公司）；N-EVAP111型旋轉蒸發器（美國Organomination公司）；TG16-WS型高速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；SK型快速混勻器（江蘇正基儀器有限公司）。丙酮為色譜純；乙腈、正己烷、氯化鈉均為分析純；敵敵畏、滅線磷、甲拌磷、甲基對硫磷、毒死蜱、倍硫磷、殺撲磷、三唑磷和伏殺硫磷標準品（純度＞99.9%）。葡萄酒樣品均購自本地超市。

農藥標準溶液：9種農藥用丙酮配制成標準儲備液，再稀釋成相應的標準工作溶液，用空白基質溶液稀釋配制成基質匹配混合標準溶液。

1.2 色譜條件

色譜柱初始溫度：70℃保持1min，然后以30℃·min-1程序升溫至130℃，5℃·min-1升溫至250℃，10℃·min-1升溫至300℃，保持3min；進樣量：1μL；進樣方式：不分流進樣；柱流量：1.2mL·min-1（恒流模式）；進樣口溫度：250℃；載氣：高純氦。

1.3 質譜條件

電子轟擊源：70eV；EI離子源溫度：230℃；MS接口溫度：280℃；測定模式為多反應監測離子掃描模式（MRM）。

1.4 數據處理

數據采集通過Agilent Mass Hunter Acquisition軟件完成，數據處理利用Agilent Mass Hunter Quantitative Analysis軟件完成。

1.5 樣品處理

準確吸取5.0mL樣品置于50mL聚丙烯具塞離心管中，加入10mL乙腈，用液體混勻器在2500·r·min-1均質提取1min。加入2～3g氯化鈉，再均質1min，將離心管放入離心機，在6000·r·min-1離心3min，取上清液5mL，在50℃下氮吹濃縮至近干，用一定體積比的正己烷丙酮混合溶液定容至1mL（如樣品有雜質經0.2μm濾膜過濾），供氣相色譜串聯質譜測定。

2 結果與討論

2.1 MLLE法提取條件的優化

傳統的LLE法是在分液漏斗中進行，耗時費力，且成本較高。而本研究開發的MLLE法是在50mL離心管中進行，快捷方便，節約成本，利于環保，適用于液體樣品的分析。農藥殘留常見的提取劑有乙腈、丙酮、正己烷和乙酸乙酯等。相同條件下采用不同溶劑提取進行比較，發現使用乙腈和丙酮提取效果最好。以毒死蜱為例，4種不同溶劑回收率分別為85.3%、80.6%、73.6%、和62.7%，但由于丙酮極性大溶解色素雜質比較多，基質干擾嚴重，而乙腈通用性強，對農藥溶解度較大，可溶入的雜質量適中，因此選擇乙腈作為提取溶劑，既保證了農殘的提取效率又降低了基質干擾。不同提取溶劑對葡萄酒中有機磷農藥提取效果的比較見圖1。

圖1 不同提取溶劑對葡萄酒中有機磷農藥提取效果的比較Table 1 Extraction eficlency of pesticides in grape wine samples by different solvents

2.2 氣相色譜-質譜條件的優化

在氣相色譜串聯質譜聯用檢測過程中，為了保證定性和定量的準確，必須對待測物的母離子和子離子、碰撞能量、掃描時間及監測反應離子的數目等一系列參數和質譜條件進行優化，以期達到最佳的檢測效果。為優化出最佳的質譜條件，本實驗在固定色譜條件下，通過優化碰撞能量（5～50ev）獲得產物離子，最后采用多反應監測（MRM）模式，按保留時間分配采集時間進行掃描（MRM參數見表1），在保證每一種組分都具有良好峰形的前提下，達到了較高的靈敏度。在上述色譜條件下，得出混合標樣的MRM譜圖（見圖2），在MRM模式下，對被測組分進行分離，敵敵畏、滅線磷、甲拌磷、甲基對硫磷、毒死蜱、倍硫磷、殺撲磷、三唑磷和伏殺硫磷9種農藥均可較好地分離。

圖2 9種農藥混合標準溶液的多反應監測（MRM）圖Figure 2 MRM chromatogram of standard solution of 9 pesticides standard solution

表1 9種有機磷農藥的MRM參數Table 1 Mass spectrum parameters of 9 organophosphorous pesticides at MRM scan mode

2.3 標準曲線、線性范圍及檢出限

將標準溶液分別稀釋成濃度0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00μg·mL-1，在本方法所確定的實驗條件下進行測定，并繪制標準曲線，在上述濃度范圍內，敵敵畏、滅線磷、甲拌磷、甲基對硫磷、毒死蜱、倍硫磷、殺撲磷、三唑磷和伏殺硫磷的濃度分別與其峰面積呈良好的線性關系。以3倍信噪比（S/N=3）計算得到9種有機磷的檢出限均為0.005mg·L-1。以10倍信噪比（S/N=10）計算得到9種有機磷的定量限均為0.01 mg·L-1，結果見表2。

表2 9種有機磷農藥的回收率和精密度（n=6）Table 2 Recovery and precision of 9 organophosphorous pesticides（n=6）

2.4 方法精密度和回收率的測定

在陰性葡萄酒的樣品中分別添加3個濃度的添加水平，分別為0.02mg·L-1、0.10mg·L-1和0.20mg·L-1，對敵敵畏、滅線磷、甲拌磷、甲基對硫磷、毒死蜱、倍硫磷、殺撲磷、三唑磷和伏殺硫磷測定回收率，每個水平均平行處理測定6個樣，計算平均回收率及精密度，結果見表2。經測定，平均回收率在70%～110%之間，相對標準偏差小于10%，本方法中農藥組分測試結果處于可接受范圍內，實現了葡萄酒中9種農藥殘留的快速定性與定量分析，采用MRM模式，對目標物不產生干擾，達到了較高的靈敏度，葡萄酒空白樣品中添加有機磷農藥的MRM圖見圖3。從圖可知采用本法對葡萄酒的處理，可以很好的去除色素等雜雜質的干擾。

圖3 葡萄酒空白樣品中添加有機磷農藥的MRM圖Figure 3 MRM chromatogram of organophosphorous pesticides standards in blank grape wine amples

2.5 實際樣品的測定

采用本文建立的方法對市場上的50份葡萄酒樣品進行檢測，在葡萄酒中檢出甲基對硫磷和毒死蜱2種有機磷農殘，有機磷農殘含量在0.06～0.22mg·L-1之間，表明所購葡萄中含有有機磷殘留且經發酵釀酒過程仍有部分農藥殘存于酒中。

3 結論

本研究采用微液液提取方法結合氣相色譜串聯質譜檢測技術，建立葡萄酒中9種農殘的檢測方法。該方法前處理簡單、快捷，縮短檢測時間，減少有機溶劑的使用量，節能環保；采用氣相色譜串聯質譜技術減小基質干擾，化合物背景噪音更低，響應值較高，提高檢測靈敏度，減少“假陽性”風險。檢測低限可滿足目前法規中對葡萄酒中各農藥殘留限量的要求。并對方法的線性范圍、回收率、精密度、檢測限等進行評價和驗證，各項指標均符合《殘留分析質量控制指南》要求。該方法靈敏、高效，可用于葡萄酒中多種有機磷農藥殘留的快速分析檢測，并為其他葡萄酒檢測技術的發展提供參考。