白花丹素對肝癌細胞增殖遷移凋亡能力的影響及其作用機制研究

韓淑蘭，段昊雨，孫丹丹，宋柳，鄒宜芳，初迪，李歡，郭建鋒

（吉林大學藥學院，吉林 長春 130021）

在過去的幾十年中，癌癥一直是威脅人類健康和生命的主要殺手。據統計，2018年全球有1 810萬癌癥新發病例和960萬死亡病例，呈逐年上升的趨勢[1]。原發性肝細胞癌是中國第四大常見的惡性腫瘤，也是造成腫瘤相關死亡的第二大原因[2]。手術切除部分肝臟并輔以藥物治療是治療肝癌的首選方案。但由于原發性肝癌的高復發率和高轉移率，患者的預后較差，5年生存率低[3]。因此，尋找一種能夠有效降低原發性肝癌遷移率和復發率的輔助治療藥物有重要意義。

白花丹素（plumbagin,PLB），又名蘭雪醌，是從傳統植物藥白花丹（Plumbago zeylanica L.）中提取出的萘醌類天然活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌和抗炎等多種藥理作用[4]。據文獻報道，白花丹素對肺癌[5]、胰腺癌[6]、前列腺癌[7]和肝癌[8]等多種癌細胞有明顯的抑制作用，然而其對多種肝癌細胞作用的分子途徑尚不明確。因此，本研究將白花丹素作用于人源和鼠源兩種肝癌細胞，探究其對肝癌細胞增殖、遷移和凋亡能力的影響，并揭示其作用分子機制，為白花丹素的臨床應用提供理論依據和潛在的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

白花丹素購自上海同田生物技術有限公司；噻唑藍（MTT溶液，純度≥98%）購自美國Sigma Aldrich公司；結晶紫染液購自沈陽科托化工有限公司；胎牛血清、胰酶、DMEM培養基和磷酸鹽緩沖液均購自美國Thermo Fisher公司；二甲基亞砜（DMSO溶液，純度≥98%）、甲醇（純度≥99%）、三羥甲基氨基鹽酸鹽（Tris）、甘氨酸（Glycine）和Tween 20均購自國藥集團化學試劑有限公司；兔抗鼠一抗和羊抗兔二抗購自美國Affinity Biosciences公司；蛋白提取試劑盒和Western Blotting試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；SMMC-7721人肝癌細胞和Hepa 1-6小鼠肝癌細胞屬于吉林大學微生物與生物藥學教研室；FL600型酶標儀購自美國Bio-Tek公司；FACSCanto流式細胞儀購自美國BD公司；TDZ4-WS低速臺式離心機購自長沙湘儀有限公司；GL-8813渦旋混合器購自瑞金儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；Tanon-4500凝膠成像系統購自上海天能科技有限公司；CKX53倒置相差顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社；Eppendorf移液器購自德國Eppendorf有限公司。

1.2 細胞培養

SMMC-7721人肝癌細胞和Hepa 1-6小鼠肝癌細胞培養于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的DMEM培養基中，于37℃、飽和濕度、5% CO2恒溫培養箱中培養，當細胞長至90%時，以1:3的比例進行傳代，待細胞處于對數生長期時進行實驗。

1.3 MTT法檢測白花丹素對肝癌細胞的生長抑制率

分別取對數生長期的SMMC-7721人肝癌細胞和Hepa 1-6小鼠肝癌細胞以1 104個/孔接種于96孔板中，置于恒溫細胞培養箱中培育過夜。設置DMSO處理組為對照組、不加藥的空白組和不同濃度的白花丹素（2.5mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L和60mol/L）處理組，每組平行設置4孔，處理24 h，加入MTT 20L，在37℃、5% CO2恒溫培養箱中孵育4 h，棄去培養液，加入DMSO150L，避光震蕩10 min，待藍紫色結晶充分溶解后，用酶標儀在570 nm處測量吸光度，并計算細胞存活率和抑制率，實驗重復3次。細胞抑制率公式為：

1.4 平板單克隆實驗檢測細胞增殖活力

分別取對數生長期的SMMC-7721人肝癌細胞和Hepa 1-6小鼠肝癌細胞，以1 103個/孔接種于6孔板中，加入不同濃度的白花丹素（2.5mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L和60mol/L），以DMSO組為對照組，放入恒溫培養箱，培育2周，當6孔板中出現肉眼可見細胞克隆團時停止培養，棄去培養液，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定，加入結晶紫染液染色，顯微鏡計算細胞克隆數。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移

分別取對數生長期的SMMC-7721人肝癌細胞和Hepa 1-6小鼠肝癌細胞以1 105個/孔接種于24孔板中，置于恒溫培養箱中培育過夜，待細胞長滿至90%孔底時，用滅菌的200L移液槍槍頭垂直于板，沿預先畫好的標記線進行劃痕，使用PBS洗滌3次，加入含有2%胎牛血清的DMEM培養液及不同濃度的白花丹素（2.5mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L和60mol/L），以DMSO組為對照組，放入恒溫培養箱。在0 h和48 h拍照，使用Image J軟件測量劃痕面積并計算劃痕愈合率。劃痕愈合率計算公式為：

愈合率=（0 h劃痕面積48 h劃痕面積）/0 h劃痕面積100%。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

分別取對數生長期的SMMC-7721人肝癌細胞和Hepa 1-6小鼠肝癌細胞以5 105個/孔接種于6孔板中，并放入恒溫培養箱中培養過夜，待細胞貼壁后加入IC50濃度的白花丹素處理12 h和24 h，以DMSO為對照組。用細胞凋亡試劑盒中7-AAD和ANNEXINPE雙染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，用FlowJo軟件分析數據。

1.7 Western blot檢測細胞凋亡通路相關蛋白的表達

分別取對數生長期的SMMC-7721人肝癌細胞和Hepa 1-6小鼠肝癌細胞，加入IC50濃度的白花丹素，處理6 h、12 h和24 h后提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。各組取20L等量蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白條帶電轉到PVDF膜上，轉膜結束后，將PVDF膜以適量的TBST清洗，加入1%封閉液封閉1 h，加入兔抗鼠一抗（Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Caspase-9、-actin，比例為1:2 000），4℃孵育過夜，次日早晨用TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min，加入羊抗兔二抗（1:5 000），室溫下避光孵育1 h，TBST清洗3次。配制ECL顯影液，將PVDF膜浸泡在顯影液中孵育1 min，使用化學發光凝膠成像儀對目標蛋白條帶進行掃描成像，使用Image J軟件計算各組蛋白條帶灰度值，計算蛋白條帶相對表達量。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 白花丹素對細胞生長抑制率的影響

實驗結果顯示，與DMSO對照組相比，不同濃度白花丹素（2.5mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L和60mol/L）處理24 h后，SMMC-7721生長抑制率分別為（4.27±3.43）%、（14.61±3.8）%、（20.73±6.52）%、（41.31±5.29）%、（61.07±4.86）%和（79.30±7.07）%，IC50為（26.78±6.22）mol/L（圖1A）；Hepa 1-6生長抑制率分別為（3.66±3.01）%、（14.17±8.3）%、（22.91±5.2）%、（48.15±6.52）%、（74.67±6.33）%和（87.08±7.56）%。IC50為（21.40±2.52）mol/L（圖1 B）。上述結果表明，白花丹素對細胞生長有明顯抑制作用（P＜0.05），且呈藥物濃度依賴性。

圖1 白花丹素對肝癌細胞生長的抑制作用Fig.1 The inhibitory effect of PLB on the viability of hepatoma cells

2.2 白花丹素對細胞增殖能力的影響

分別采用不同濃度白花丹素溶液處理SMMC-7721細胞和Hepa 1-6細胞，在細胞培養箱中培養2周后拍照（圖2A），比較集落形成率。如圖2B所示，SMMC-7721細胞被不同濃度白花丹素處理后，集落形成數為（320.67±18.52）個、（236.33±20.13）個、（164.33±15.87）個、（115.00±23.69）個、（79.33±15.67）個、（40.67±9.08）個和（23.33±3.08）個；Hepa1-6集落形成數為（361.67±25.88）個、（287.33±32.89）個、（220.67±19.95）個、（143.33±25.67）個、（87.33±15.87）個、（50.00±9.88）個和（23.33±8.31）個。因此，與對照組DMSO相比，藥物處理組的集落形成數明顯下降（P＜0.05），且隨藥物濃度的不斷增加，集落形成數不斷減少，表明白花丹素抑制了SMMC-7721和Hepa1-6細胞的增殖。

圖2 不同濃度白花丹素對細胞增殖能力的影響Fig.2 The effect of different concentration of PLB on the cell proliferation

2.3 白花丹素對肝癌細胞遷移率的影響

采用不同濃度白花丹素溶液分別處理SMMC7721細胞和Hepa 1-6細胞，在0 h，48 h進行拍照（圖3 A），比較細胞遷移率。如圖3 B所示，經過不同濃度白花丹素處理后，SMMC-7721細胞遷移率為（83.01±2.12）%、（75.23±4.32）%、（62.35±3.87）%，（53.67±5.01）%、（14.78±2.13）%、（6.52±1.23）%和（4.71±1.21）%（圖3 B）；Hepa1-6細胞遷移率為（80.93±4.67）%、（76.23±4.35）%、（66.56±3.67）%、（52.14±5.23）%、（9.67±4.78）%、（7.96±3.96）%和（5.65±3.80）%（圖3 C）。以上結果表明，與對照組DMSO相比，處理組劃痕愈合逐漸減少，細胞遷移率顯著降低（P<0.05）。因此白花丹素有效抑制SMMC-7721和Hepa 1-6細胞遷移，細胞遷移率隨藥物處理濃度增加而減少。

圖3 白花丹素對細胞遷移率的抑制作用Fig.3 The inhibitory effect of plumbagin on cell mobility

2.4 白花丹素對肝癌細胞凋亡情況的影響

分別采用IC50濃度的白花丹素處理細胞SMMC-7721（26.78mol/L）和Hepa 1-6（21.4mol/L）12 h和24 h，以DMSO組為空白對照組，采用細胞凋亡檢測試劑7-AAD和ANNEXIN-PE處理細胞，之后采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況（圖4 A）。結果如圖4 B所示，在DMSO對照組中，SMMC-7721細胞凋亡率為（2.79±2.38）%，藥物處理12 h和24 h后細胞凋亡率分別為（22.16±4.58）%和（54.11±6.96）%。同樣，Hepa 1-6細胞對照組凋亡率為（3.76±2.38）%，藥物處理12 h和24 h后，細胞凋亡率分別為（20.20±3.05）%和（40.77±5.04）%。兩組細胞凋亡結果相似，以上結果顯示，與DMSO對照組相比，白花丹素處理組的細胞凋亡率顯著增高（P＜0.01），且凋亡率呈時間依賴性。

圖4 白花丹素對細胞凋亡率的影響Fig.4 Effect of PLB on apoptosis rate

2.5 白花丹素處理前后細胞凋亡相關蛋白表達變化

分別采用IC50濃度的白花丹素溶液處理細胞SMMC-7721（26.78mol/L）和細胞Hepa1-6（21.4mol/L）6 h，12 h和24 h后提取蛋白，用Western blot法測定各組蛋白表達情況。結果如圖5所示，與DMSO對照組相比，處理組Bcl-2表達量在6 h時，與對照組無統計學差異；在12 h和24 h時，Bcl-2表達量顯著下降，且與處理時間呈正相關關系（圖5 A）；SMMC-7721細胞Bax表達量、Caspase-3和Caspase-9激活量隨藥物處理時間延長而增加（圖5 A），提示在24 h時，SMMC-7721細胞凋亡過程最活躍。如圖5 B所示，Hepa 1-6細胞Bax表達量和Caspase-9激活量在處理12h時達到最大值，提示處理12h時，大量Hepa1-6細胞的凋亡通路被激活；Caspase-3激活量隨處理時間延長而增加，在24 h到達最大值（圖5 B），此時凋亡過程最活躍。

3 討論

原發性肝細胞癌（HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，盡管多種傳統治療方法已應用于肝癌的臨床治療，但因其高轉移率及高復發率，患者常常預后不佳，5年生存率低于40%[9,10]。近年來，中醫中藥在癌癥治療中發揮了日益顯著的作用，中藥及其提取物能作用于癌細胞生命周期的多個階段，具有多靶點、毒副作用小及難產生耐藥性的特點[11]。白花丹素是我國傳統中藥白花丹的根部提取物，屬于天然有效活性成分，研究表明，白花丹素具有一定的抑制癌細胞增殖的作用[5-7]，是一種潛在的抗癌藥物。然而，肝癌發病機制不一、癌細胞類型復雜多樣，雖有報道稱白花丹素通過抑制基質蛋白酶產生抑制HepG2肝癌細胞遷移[8]，但白花丹素對多種肝癌細胞的抗癌作用機制目前尚不明確，阻礙了其臨床廣泛應用。因此，深入研究白花丹素對多種肝癌細胞的作用效果及機制，對于進一步闡明并推動白花丹素的臨床抗肝癌應用具有重要的意義。本研究系統探究了白花丹素對兩種肝癌細胞（SMMC-7721和Hepa 1-6）增殖、遷移與凋亡的影響及其作用機制。

MTT實驗與平板單克隆形成實驗結果顯示，白花丹素對肝癌細胞生長和集落形成能力與藥物濃度呈正相關關系，說明白花丹素在體外有較強的抑制肝癌細胞增殖的能力。肝癌患者預后較差的重要原因之一就是癌細胞易發生侵襲和轉移。因此，降低肝癌細胞的遷移能力，是預防其侵襲和轉移的有效手段。在本研究中，劃痕實驗結果顯示，白花丹素能有效抑制肝癌細胞的遷移能力，且遷移率隨藥物濃度升高而降低，遷移率最終降低至4.71%±1.21%（SMCC-7721）和5.65%±3.80%（Hepa 1-6），說明白花丹素在體外有較強的抑制肝癌細胞遷移的能力。

細胞凋亡是一種程序性的細胞死亡，當細胞所處的環境發生變化，如接觸化學藥物時，凋亡通路被激活，出現細胞凋亡[12,13]。有研究表明，藥物可通過內源性線粒體途徑誘導細胞凋亡[14,15]，而線粒體介導的凋亡途徑主要依賴Bcl-2家族蛋白調控，其中包括凋亡抑制蛋白Bcl-2和凋亡誘導蛋白Bax[16-18]。當外源刺激激活Bax蛋白時，Bax作用于線粒體外膜，引起線粒體外膜通透化（Mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP），線粒體膜間隙的細胞色素C（cytochrome C）釋放進入胞質，促使Caspase-3和Caspase-9激活[19,20]，激活的Caspase-9（Cleaved-Caspase-9）切割凋亡執行蛋白Caspase-3，然后，活化的Caspase-3（Cleaved-Caspase-3）使聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP）裂解，最終導致細胞凋亡[21]，而抑制凋亡蛋白包括Bcl-2，能夠抑制MOMP作用，從而阻止這個過程[22]。本研究結果顯示，白花丹素上調了Bax蛋白表達水平，下調了Bcl-2蛋白表達水平；活化的Caspase蛋白與未活化的Caspase的比值隨處理時間延長而升高，表明Caspase-3和Caspase-9被激活，且激活程度與處理時間呈正相關關系，說明白花丹素在體外有較強的誘導細胞凋亡的能力，其誘導細胞凋亡的作用機制與內源性線粒體凋亡途徑密切相關。

綜上所述，白花丹素可抑制肝癌細胞的增殖與遷移，并有效誘導細胞凋亡，且呈劑量-時間依賴性，同時，白花丹素可下調凋亡抑制蛋白Bcl-2表達水平，上調凋亡相關蛋白Bax的表達，并促進凋亡執行蛋白Caspase-3的激活以促進細胞凋亡，因此，白花丹素具備成為有效治療肝細胞癌的藥物的潛能。本研究為白花丹素的臨床抗肝癌應用提供了理論基礎和實驗依據。