基于網絡藥理學探究馬齒莧與枳椇治療糖尿病的異同分析

陳成龍，劉蘭玲，史繼童，顏培正，李佳，趙東升

（山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355）

糖尿?。╠iabetes mellitus,DM）是一種伴隨因胰島 素分泌缺陷或生物作用受損引起的糖、脂肪和蛋白質代謝紊亂的異質性疾病[1]，屬于中醫“消渴”、“消癉”和“三消”范疇[2]。中國糖尿病患者總數高居世界第一，大約11%的人患有糖尿病[3,4]。中藥由于毒性低、副作用小等特點在治療糖尿病方面有著不可替代的優勢。

馬齒莧（Purslane oleracea,PO），味酸，對“消渴”病的病機陰虛燥熱具有清熱解毒、益氣生津及散血消腫的作用[5]。枳椇（Hovenia dulcis,HD），味甘、酸，具有清熱生津、止渴除煩等作用[6]。性味及功能主治提示兩味藥均可治療糖尿病，并已有研究報道證實[7-9]，但其物質基礎和潛在機制的異同點尚未得到闡釋。

網絡藥理學是在生物信息學、系統生物學與多向藥理學等學科的基礎上提出的一種新方法學科，并已在中藥物質基礎和作用機制研究中廣泛應用[10,11]?；诖?，我們利用網絡藥理學技術研究馬齒莧、枳椇治療糖尿病的物質基礎及作用機制差異，為進一步深入研究開發和利用藥食同源中藥治療糖尿病提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 PO與HD成分靶標匯總

采用ETCM（http://www.tcmip.cn/）、TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）數據庫收集PO與HD成分。利用Discovery Studio 2016對符合Lipinski規則的化合物進行藥代動力學評價：人類腸道吸收性（HIA）為0或1為優；水溶解度（AS）為3或4。Lipinski規則為分子量（MW）小于500，氫鍵供體（Hdon）數目小于5，氫鍵受體（Hacc）數目小于10，脂水分配系數（AlogP）小于5，可旋轉鍵（RK）的數量不超過10。

利用SwissTarget Prediction服務器預測PO與HD成分靶標，UniProt校正名稱。以probability＞0為標準收集有效靶點。

1.2 DM基因匯總

以“Diabetes”、“Diabetes Mellitus”為關鍵詞分別在DisGeNET（https://www.disgenet.org/）、Genecards（https://www.genecards.org/）數據庫檢索疾病基因，并以score＞0.5（DisGeNET）和score＞50（Genecards）為標準篩選有效基因。

1.3 蛋白互作網絡（PPI）構建

采用Venny2.1繪制韋恩圖獲取PO、HD治療DM共有靶點與特有靶點。運用STRING數據庫構建PO與HD調控DM共有靶點和特有靶點PPI網絡。Cytoscape3.7.0軟件進行PPI網絡可視化。

1.4 構建“中藥-成分-靶點-疾病”網絡

將PO與HD防治DM的共有和特有靶點分別導入Cytoscape3.7.0，構建“中藥成分靶點疾病”網絡。

1.5 靶點生物功能注釋

使用R4.0.3軟件，利用Bioconductor（https://www.bioconductor.org/）的org.Hs.eg.db，colorspace，stringi，DOSE，clusterProfile，pathview，ggplot2和limma等程集包，對篩選的共有和特有靶點進行GO功能和KEGG通路分析（校正P＜0.05）。

2 結果

2.1 基礎信息匯總

通過檢索數據庫得到PO、HD成分分別為58個、45個，經篩選獲得PO、HD成分分別為24個、19個（表1），共有成分為芹菜素（apigenin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）和楊梅素（myricetin）。Swiss Target Prediction預測靶點數目分別為395個、367個，數據庫匯總DM基因856個。將化合物靶點與DM相關基因取交集，得到PO、HD治療DM的特有靶點分別為42個、34個，共有靶點66個（圖1）。

圖1 交集靶點韋恩圖Fig.1 Intersection targets from the Venn diagram

表1 成分基本信息Table 1 The basic information of components

續表

2.2 關鍵成分篩選

建立“中藥成分靶點疾病”網絡（圖2），包含182個節點和712條相互關系，平均每個化合物連接14個靶點。通過分析網絡拓撲性質，得到網絡中起到樞紐作用的化合物。PO中度值較大的成分為5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one、芥子酸（sinapic acid）、木犀草素（luteolin）、咖啡酸（caffeic acid）和HD中為柚皮素（naringenin），共有成分為芹菜素（apigenin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）和楊梅素（myricetin），見表2。

圖2 “中藥-成分-靶點-疾病”網絡Fig.2 The network of"Herb-Component-Target-Disease"

表2 關鍵成分排名（前10）Table 2 The rank of key components(Top 10)

2.3 關鍵靶點篩選

Cytoscape3.7.0構建藥材干預DM的主要作用靶點PPI網絡。共有靶點度值排名靠前的為AKT1（44）、EGFR（33）、PTGS2（31）、ESR1（30）、STAT3（26）、CXCL8（27）、PPARG（23）、PIK3CA（21）、IGF1R（19）和SERPINE1（17）（圖3 C），在二者防治DM的過程中占主要地位。PO特有靶點排名靠前的為GAPDH（20）、MAPK8（19）、MAPK1（19）和TLR4（10）（圖3 A），而HD為VEGFA（16）、ICAM1（9）、MAPK14（9）和HMOX1（8）（圖3 B）。

圖3 蛋白-蛋白互作網路Fig.3 The PPI network

2.4 靶點生物功能注釋

2.4.1 共有靶點共有靶點調控DM涉及1 595條生物過程，與DNA結合、轉錄因子活性的調控、氧化應激反應RNA分解代謝過程和DNA代謝過程的調控等生物過程有關；涉及134個細胞組分，與黏著、細胞-基底連接等細胞組分有關，涉及162個分子功能，與泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合等分子功能有關（圖4 A）。涉及122條通路，主要有PI3K-Akt、糖尿病心肌病、RAGE（糖尿病并發癥）、脂質與動脈粥樣硬化、cAMP和AMPK等信號通路（圖4 B）。

圖4 共有靶點生物功能注釋Fig.4 The biological function annotation of common targets

2.4.2 PO特有靶點PO特有靶點調控DM涉及1 432條生物過程，與RNA分解代謝過程和DNA結合轉錄因子活性的調控等生物過程有關；涉及127個細胞組分，與黏著、細胞基底連接等細胞組分有關；涉及154個分子功能，與泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合等分子功能有關（圖5 A）；涉及117條通路，主要有PI3K-Akt、糖尿病心肌病、脂質與動脈粥樣硬化、甲狀腺激素、鈣、RAGE（糖尿病并發癥）、cAMP、AMPK和Ⅱ型糖尿病等信號通路（圖5 B）。

圖5 PO特有靶點生物功能注釋Fig.5 The biological function annotation of PO specific targets

2.4.3 HD特有靶點HD調控DM涉及547條生物過程，與翻譯后蛋白修飾、蛋白質DNA復合物組裝等生物過程有關；涉及43個細胞組分，與主軸、黏著等細胞組分有關；涉及55個分子功能，與泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合等分子功能有關（圖6 A）；涉及11條通路，有PI3K-Akt、脂質與動脈粥樣硬化、Ras、Rap1、MAPK和RAGE（糖尿病并發癥）等信號通路（圖6 B）。

圖6 HD特有靶點生物功能注釋Fig.6 The biological function annotation of HD specific targets

3 討論

《千金要方·食治篇》記載：“知其所犯，以食治之，食療不愈，然后命藥”，且藥食同源治療DM能夠平衡各個器官功能，有效控制血糖和預防糖尿病并發癥[12]。馬齒莧、枳椇被收載于《國家藥食同源目錄》，藥用和食用歷史悠久。因此，采用網絡藥理學技術對二者治療糖尿病的物質基礎及作用機制進行對比，并分析其異同點。

“中藥成分靶點疾病”網絡顯示，PO、HD防治糖尿病的物質基礎既存在共同點又具有明顯差異。PO與HD共同通過槲皮素、楊梅素等防治DM，此外，PO中的木犀草素、咖啡酸和芥子酸與HD中的柚皮素在防治DM過程中起到非常重要的作用。槲皮素能增加MAPK表達水平而減輕大鼠外周胰島素抵抗[13]。木犀草素通過抑制大鼠胰腺TLR4表達改善胰島素抵抗作用[14]。柚皮素能激活AMPK/Nrf2/HO-1信號通路，增強抗氧化反應，減輕糖尿病小鼠心肌損傷[15]。

分析PPI網絡發現，PO與HD共有靶點度值排名靠前的靶點居多，有AKT1、PPARG、PIK3CA和SERPINE1等，說明兩者除共有成分外，二者的特有成分也能通過作用共同靶點來發揮療效。分析兩味藥材的特有靶點，發現HD涉及靶點數目遠遠少于PO，說明PO發揮療效的物質基礎更廣，干預的靶點與通路更多。富集分析結果顯示HD和PO集中在糖尿病并發癥、脂質與動脈粥樣硬化、PI3K-Akt、cAMP和AMPK等信號通路。胰島素通過激活PI3K/AKT信號通路，調節血脂和葡萄糖代謝平衡[16]。PPARG的激活使機體外周組織對胰島素的敏感性增加，抑制肝臟糖異生，脂肪組織脂肪酸分解抑制、合成增加等[17]。PO特異地作用于甲狀腺激素、鈣和Ⅱ型糖尿病等信號通路，HD特異地作用于Ras、MAPK信號通路。胞內Ca2+濃度升高觸發胰腺 細胞分泌胰島素，Ca2+通道和活性的改變對胞內鈣濃度及胰島素的分泌都起到關鍵作用[18]。藥物干預cAMP信號通路可增加電活動和Ca2+信號，此外，cAMP還有助于胰島素合成、細胞分化和增殖[19]。

本研究通過共有成分和特有成分的靶點分析，闡釋了PO、HD在防治DM方面的物質基礎和潛在作用機制差異，為進一步研究開發和利用馬齒莧、枳椇資源提供參考，也為深入揭示藥食同源中藥的藥效物質基礎和作用機制研究提供一定的理論依據。