濕寒證大鼠模型的構建及其評價

穆妮熱·排爾哈提，古麗娜孜·肉孜，買買提明·努爾買買提，海力里·麥麥提，阿衣努爾·買提斯迪克

（新疆醫科大學維吾爾醫學院，烏魯木齊 830011）

證候是中醫學認識疾病的主要模式，是中醫四診信息的高度概括和歸納[1]，證候模型是研究疾病發生發展的有效工具[2].，病因造模法是證候模型的經典制備思路[3].。傳統醫學認為，環境、膳食及精神因素是導致證候的潛在病因。本研究選取臨床濕寒證致病因素（濕寒環境及膳食）施加于實驗大鼠，觀察大鼠外在生物表征，測定相關指標的變化，并“以方測證”來證實模型成立，為濕寒證本質研究提供模型支持。

1 材料與方法

1.1 動物SPF 級雌性SD 大鼠30只，體重(240±10)g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供，合格證號:IACUC20190916-01，動物生產許可證[ SCXK（新）2018-0002]。適應性喂養5 d 按隨機數字表法隨機分為3 組，正常對照組、濕寒證模型組、藥物反證組，各組10 只。

1.2 主要試劑與儀器ACTH 試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號202009) ; CORT 試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號202009)；濕寒證對應方（新疆維吾爾自治區維吾爾醫院提供，標準號MZJW-0113-2013）；寒涼性飼料（委托江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司加工）；RQH-350 型人工氣候箱（上海精宏實驗設備有限公司）；S-3400N型掃描電鏡（日本日立公司）。

1.3 模型建立與給藥方法濕寒證模型組給予寒涼性飼料（基礎飼料70%+芫荽實、菠菜實30%），控制人工氣候箱條件，模擬濕寒飼養環境[室溫（6±1）℃，相對濕度85%～95%]，外加冷水游泳[（水溫:（6±1）℃，1 d/次、持續5 min]等因素持續刺激24 d，觀察不同時間段相關指標的變化，并與正常對照組進行比較；藥物反證組，造模的第1天開始，受濕寒應激前1 h灌胃濕寒證對應方藥，給藥濃度為0.35 g/100 g，灌胃容量為1mL/100 g，相當于臨床用量等效劑量的6 倍，每日1次，連用24 d，觀察相關指標，并與正常對照組、濕寒證模型組進行比較。

1.4 觀察指標

1.4.1 大鼠外觀表征 觀察并記錄各組大鼠的外觀表征并評分，見表1。

表1 大鼠外觀表征評分表

1.4.2 定量指標 體重：每日固定時間稱量；攝食量=（每籠中加入飼料量－24 h 后剩余量）/大鼠只數；攝水量=（每籠中加入飲用水量－24 h 后剩余量）/大鼠只數。

1.4.3 大鼠血清ACTH、CORT 的測定 Elisa 法檢測大鼠血清ACTH、CORT 水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.4 舌體表面組織形態學觀察 取材后，將舌體樣本置于掃描電鏡下，觀察舌體顯微結構。

1.5 統計學分析采用SPSS 23.0 進行數據分析，所有數據進行正態性檢驗，并進行方差齊性檢驗；體征評分值，體重、攝食水量用一般線性模型(general lin?er model)重復測量法進行方差分析；大鼠血清應激相關指標用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠外觀表征觀察結果造模結束時，正常對照組體毛稠密光滑，行動活潑，精神佳，食欲可，眼睛明亮，反應尚可，大小便正常；濕寒證模型組大鼠一般狀態有不同程度的改變，鼻部、爪部色澤變淡，舌質暗，舌苔白膩明顯，蜷臥少動，大便濕軟，尿色清；藥物反證組大鼠精神狀態一般，反應尚靈活，體毛稍有散亂，鼻部、爪部色澤紅潤或稍淡，大便偶有干濕不調。

2.2 3 組大鼠外觀表征評分的比較造模前各組間外觀表征評分值比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。造模第6、9、12、15、18、21、24 天，濕寒證模型組體征評分值均高于正常對照組與藥物反證組，與正常對照組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。造模第21、24天時藥物反證組與正常對照組相比，差異無統計學意義（P>0.05），與濕寒證模型組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 3組大鼠在不同時間點外觀表征評分的比較(分，±s)

表2 3組大鼠在不同時間點外觀表征評分的比較(分，±s)

注：與同一時間點的正常對照組比較，*P<0.05；與同一時間點的濕寒證模型組比較，#P<0.05。

時間造模前造模第3天造模第6天造模第9天造模第12天造模第15天造模第18天造模第21天造模第24天n 10 10 10 10 10 10 10 10 10正常對照組23.10±0.29 30.00±1.63 32.90±2.37 38.00±2.66 43.20±3.22 48.00±4.42 51.00±4.18 52.50±4.85 53.30±3.94濕寒證模型組23.00±0.29 32.50±4.22 39.90±2.99*45.20±4.07*53.40±7.82*60.50±7.97*67.70±5.07*75.30±4.52*80.10±3.72*藥物反證組22.60±0.29 32.30±6.48 36.00±6.99 41.40±6.99 52.50±6.24*54.10±5.17*#56.50±6.04*#55.90±5.85#55.20±4.44#

2.3 不同時間點3 組大鼠體重的變化造模前和造模第3、6 天，各組間體重比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。造模第9、12、15、18 天，濕寒證模型組、藥物反證組與正常對照組相比，差異均有統計學意義（P<0.05）。造模第21、24 天，藥物反證組的體重升高，與正常對照組相比，差異無統計學意義（P>0.05），與濕寒證模型組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 3組大鼠在不同時間點上的體重比較(g,±s）

表3 3組大鼠在不同時間點上的體重比較(g,±s）

注：與同一時間點的正常對照組比較，*P<0.05；與同一時間點的濕寒證模型組比較，#P<0.05。

時間造模前造模第3天造模第6天造模第9天造模第12天造模第15天造模第18天造模第21天造模第24天n 10 10 10 10 10 10 10 10 10正常對照組248.98±11.92 257.86±9.75 272.62±9.31 293.20±5.19 301.13±3.08 306.13±6.14 310.44±6.33 314.06±5.91 317.26±7.23濕寒證模型組250.66±17.39 257.86±18.03 268.36±17.50 274.38±14.32*280.88±14.23*285.74±13.44*290.35±14.23*296.35±12.62*301.17±13.70*藥物反證組239.60±6.29 249.20±7.29 260.82±11.18 271.62±12.12*282.26±9.50*289.81±8.09*298.60±5.89*308.79±4.02#310.05±3.95#

2.4 不同時間點3 組大鼠攝食量的變化造模前和造模第3 天，各組間攝食量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。造模后第9、12、15、18 天，濕寒證模型組攝食量增加，與正常對照組、藥物反證組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。造模第21、24 天，藥物反證組攝食量與正常對照組相比，差異無統計學意義（P>0.05），與濕寒證模型組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

表4 3組大鼠在不同時間點上的攝食量比較(g,±s）

表4 3組大鼠在不同時間點上的攝食量比較(g,±s）

注：與同一時間點的正常對照組比較，*P<0.05；與同一時間點的濕寒證模型組比較，#P<0.05。

時間造模前造模第3天造模第6天造模第9天造模第12天造模第15天造模第18天造模第21天造模第24天n 10 10 10 10 10 10 10 10 10正常對照組10.66±0.14 13.75±0.47 15.58±0.40 15.04±0.37 16.00±0.35 16.51±0.28 17.32±0.18 17.63±0.26 18.27±0.20濕寒證模型組10.57±0.51 13.68±0.53 16.54±0.20*18.58±0.32*19.54±0.10*19.69±0.09*20.19±0.10*20.43±0.18*20.71±0.17*藥物反證組10.41±0.38 13.98±0.61 16.56±0.32*16.97±0.50*#17.44±0.20*#17.55±0.15*#17.64±0.14*#17.72±0.17#18.15±0.12#

2.5 不同時間點3 組大鼠攝水量的變化造模前和造模第3 天，各組間攝水量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。造模后第9、12、15、18 天，濕寒證模型組、藥物反證組攝水量減少，與正常對照組相比，差異均有統計學意義（P<0.05）。造模第21、24 天，藥物反證組攝水量與正常對照組相比，差異無統計學意義（P>0.05），與濕寒證模型組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。見表5。

表5 3組大鼠在不同時間點上的攝水量比較(mL,±s）

表5 3組大鼠在不同時間點上的攝水量比較(mL,±s）

注：與同一時間點的正常對照組比較，*P<0.05；與同一時間點的濕寒證模型組比較，#P<0.05。

時間造模前造模第3天造模第6天造模第9天造模第12天造模第15天造模第18天造模第21天造模第24天n 10 10 10 10 10 10 10 10 10正常對照組17.39±0.15 18.27±0.27 20.40±0.28 22.04±0.40 23.51±0.59 24.61±0.58 25.43±0.55 25.79±0.47 26.26±0.33濕寒證模型組17.49±0.26 18.22±0.15 19.50±0.30*20.12±0.14*20.58±0.07*21.54±0.10*22.44±0.06*22.80±0.25*23.11±0.05*藥物反證組17.37±0.26 18.19±0.73 19.59±0.09*21.56±0.23*#22.46±0.04*#23.95±0.49*#24.83±0.04*#25.66±0.16#26.11±0.27#

2.6 血清ACTH、CORT 的變化結果慢性應激后，濕寒證模型組大鼠血清ACTH、CORT 水平均增高，與正常對照組相比差異有統計學意義（P<0.05）；藥物反證組血清ACTH 水平與正常對照組相比，差異無統計學意義（P>0.05），血清CORT 差異有統計學意義（P<0.05）。見表6。

表6 3組大鼠血清ACTH、CORT的變化(ng/mL,±s)

表6 3組大鼠血清ACTH、CORT的變化(ng/mL,±s)

注：與正常對照組比較，*P<0.05。

指標ACTH CORT正常對照組0.018±0.001 13.351±0.968濕寒證模型組0.021±0.002*16.173±2.427*藥物反證組0.020±0.002 15.095±1.964*

2.7 大鼠舌體表面組織形態學變化

2.7.1 3組大鼠舌體絲狀乳頭角質化程度的比較 正常對照組大鼠絲狀乳頭表面光滑，乳頭基部呈現一定的角質化；與正常對照組相比，濕寒證模型組大鼠的舌體絲狀乳頭較長，乳頭間的空隙較小，乳頭表面凹凸不平，裂紋較多,角質層較厚且角化程度較嚴重，出現剝脫現象；藥物反證組大鼠角質層較模型組薄，乳頭間的空隙較大，乳頭表面較光滑，剝落現象不明顯。結果見圖1。

圖1 3組大鼠舌體絲狀乳頭形態

2.7.2 3組大鼠舌體菌狀乳頭角質化程度的比較 正常對照組大鼠舌體菌狀乳頭中央可見味孔,中央平滑，裂紋少，周圍呈現一定的角質化；與正常對照組相比，濕寒證模型組大鼠舌體菌狀乳頭中央未見味孔，裂紋較多，周圍被角質層包裹,且角化組織較厚；藥物反證組大鼠舌體的菌狀乳頭中央可見味孔，裂紋較模型組少，角質層較少而薄。見圖2。

圖2 3組大鼠舌體菌狀乳頭形態

3 討論

濕寒證是多因長期食用濕寒屬性食物、藥品，長期居住在濕寒環境、缺乏運動等原因導致的整體性反應。證候研究中，動物模型信息的采集與分析評價方法日趨成熟。有學者提出，在證候模型的基礎上，依據辨證論治的原則，以經典方藥干預，觀察實驗動物各項指標恢復情況，“以藥反證””的方法驗證動物模型復制是否成功[4-5]。本研究所采用多病因造模法通過對大鼠進行多樣的，隨機的刺激，復制出證候動物模型。觀察動物外在表征，并進行評分賦值，舌體組織形態學變化和應激相關指標進行評價，并使用濕寒證對應方，從“方證相應”角度進行逆向辨證，判定動物模型證型屬性。

慢性應激可導致行為活動減少，動物隨應激時程延長，其行為表現為由興奮狀態轉變為抑制狀態[6]。本研究顯示，隨著造模時間的延長，大鼠在應激源的刺激下活動量明顯減少，喜扎堆，對刺激的反應度降低。濕寒證模型組大鼠皮毛蓬亂不潔，鼻、爪部色澤淡白，舌部白色厚苔明顯，精神倦怠，喜扎堆，嗜睡，小便顏色清，量明顯增多，大便細長，出現黏液便。各組外觀表征評分排序為濕寒證模型組>藥物反證組>正常對照組，其中濕寒證模型組評分值最高，造模第24天時達到80.10分。

冷暴露對大鼠的能量代謝有重要影響[7]。冷暴露4 周的雄性大鼠體重增長與對照組相比顯著性降低[8]。本研究顯示，隨著造模的進行，濕寒證模型組大鼠體重增長速度緩慢，與上述研究結果一致。環境溫度的改變能夠影響正常機體的生理功能，牛亭惠等[9]研究發現，低溫暴露能夠引起大鼠的攝食量與攝水量的增加。Zhang 等[10]研究發現，雄性布氏田鼠通過增加食物的攝入量以補償寒冷中的高能量需求。本研究顯示，濕寒證模型組大鼠攝食量與攝水量顯著性增加，可能是因為慢性應激導致動物的排泄量增加，許多內源性物質丟失，因此需要食物和水分來補充丟失的能源物質，以維持正常的代謝活動。

機體的應激反應主要由下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸來調控。下丘腦、垂體釋放促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質激素(ACTH )[11]，此外ACTH 還可激活腎上腺皮質，最終刺激皮質酮(cor?ticosterone，CORT)的合成和釋放[12]，脊椎動物發生冷應激時，血清中CORT 水平會升高[13]。CORT是HPA軸的終末產物,可反饋于HPA 軸的各個水平。ACTH和CORT 常被認為是應激相關研究最經典最重要指標之一，本研究中由于濕寒環境及寒涼性飼料，外加冷水游泳等多因素的復合作用下，濕寒證模型組的ACTH 與CORT 水平明顯上升，血清ACTH 濃度：濕寒證模型組>藥物反證組>正常對照組，濕寒證模型組與正常對照組差異顯著。血清CORT 濃度：濕寒證模型組>藥物反證組>正常對照組。提示，濕寒證大鼠HPA 軸可能處于應激狀態，從而引起ACTH 及CORT血清水平的改變。

隨著現代醫學的發展，掃描電鏡技術逐漸被運用到舌象的診斷上。本研究采用掃描電鏡技術從舌體微觀結構觀察舌體在應激狀態下的改變。本研究發現，濕寒證模型組大鼠舌體表面的絲狀乳頭間的空隙較小。在臨床上濕寒證病人的舌質呈淡紫或蒼白，這可能就與絲狀乳頭間的空隙小，且覆蓋了舌體以及舌體皮下的毛細血管有關。本研究還發現，濕寒證模型組大鼠舌體表面絲狀乳頭和菌狀乳頭角質化程度較高。舌苔是成片的絲狀乳頭以及菌狀乳頭根部的角質層構成，這與臨床上濕寒證病人舌苔較厚的現象相符。本研究顯示，藥物反證組舌體的角質化程度比濕寒證模型組低，角質層較少而薄。表明濕寒證對應方能有效防止對應“證候”的出現，但是不能完全消除其影響。方證對應是指每一具體方劑都有其適應的病證，臨床特定病癥要求有特定的方劑進行治療，當方劑的功效與其所治病證相對應時，方劑才能顯效[14]。本研究觀察了濕寒證對應方對濕寒證大鼠模型的治療作用，結果顯示濕寒證對應方在大鼠外觀生物表征、體重、攝食水量、舌體組織形態和血清ACTH 和CORT 含量方面均顯示出較好的改善作用。根據方證對應的原理，可判定此動物模型呈現出的證候為濕寒證。由此本研究進一步確定模型組大鼠表現出的特征與臨床“濕寒證”證候特征高度一致，這種造模方法可復制臨床“濕寒證”模型。

綜上所述，本研究以濕寒證的病因因素作為應激源，采用濕寒膳食及環境復合作用并模擬出大鼠濕寒證動物模型，該方法盡可能模擬濕寒證的發病條件及機制，但確切的機制尚不可知，仍需進一步的開展后續研究，為證候屬性研究提供更深入、更科學的評價體系。