基于家蠶轉錄組測序的ＳＳＲ序列分析

王暉 王敬 高妍夏 楊帆 馬寶俊 谷苗 張乘云 薛翠翠 謝巖

摘要：本研究對家蠶中腸、脂肪體進行轉錄組測序，分析SSR位點的分布規律和特征。結果表明，從17915個Unigene中共檢測到1339個SSR位點，分布在960個Unigene中。SSR位點的基序長度以1bp為主，隨著基序長度的增加，SSR位點數量逐漸減少，SSR位點間的距離和平均長度逐漸增加。家蠶SSR單核苷酸基序類型以A/T為主，占總基序數量的53.10%。SSR位點重復次數主要集中在5～12次，占總SSR位點數的87.60%，其中單核苷酸重復10次的SSR位點最多，共有368個。家蠶轉錄組SSR基序長度分布范圍為10～688bp，高度多態性SSR位點（長度≥ 20bp）有253個，占比18.89%。960個Unigene中分別有125、122個在GO、KEGG數據庫中得到功能注釋，主要包括蛋白結合、DNA結合、剪接體、代謝途徑等通路。隨機選擇20對EST-SSR引物進行驗證，發現19條引物擴增成功。

關鍵詞：家蠶;轉錄組測序;簡單重復序列（SSR）;特征分析

中圖分類號：S881.2+6文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2022）01-0014-07

家蠶作為目前唯一被人類完全馴化的無脊椎動物，具有生長周期短、經濟效益好等優點。中國家蠶養殖歷史悠久，古代中國的家蠶通過絲綢之路傳播，逐漸演化出許多地方品系，之后傳播到歐洲、東亞、南亞等國家，并形成當地特有品種[1]。目前國內常見的家蠶品系可分為中系、日系等，中系家蠶品種主要有菁松、新松、蘇春、浙蕾甲等，日系家蠶品種主要有皓月、東肥、白云、玉種等[2]。此外，還有一些特色地方品種，如孝豐17號、安吉7號、余杭11等;一部分由引進的日系品種改良選育而成的新品種，如蘇7、蘇10、蘇14等[3]。由于家蠶品系、品種、雜交種眾多，根據形態特征已難以進行準確的種間鑒定。

分子標記是能反映生物基因組差異的特異性的DNA片段，由于具有位點數量多、多態性高、檢測技術簡單快捷等優點，已廣泛應用于動植物品種選育、物種親緣關系鑒定、基因定位等領域[4]。目前已報道的分子標記主要有RFLP（限制性內切酶片段長度多態性）、RAPD（隨機擴增多態性DNA）、SSR（簡單重復序列）等。SSR為目前最常用的分子標記，基于基因組或轉錄組序列信息開發，可分為基因組SSR標記和表達序列標簽SSR（EST-SSR）標記。EST-SSR標記在團頭魴[5]、文蛤[6]、螞蟥[7]、紅腹錦雞[8]、綿羊[9]等物種的種群遺傳結構分析、遺傳多樣性分析、QTL定位方面已有報道?；诓煌募倚Q品種，AFLP[10]、RAPD[11]、SSR[12]分子標記均表現出較好的鑒別力。隨著高通量測序技術的進步和成本的降低，從轉錄組測序數據中可以挖掘出更多的SSR分子標記。

本研究選擇代表性家蠶品種，獲得家蠶重要的消化（中腸）、免疫器官（脂肪體）的轉錄組數據，對轉錄組數據庫中的SSR位點進行篩選和分析，研究其分布規律，并通過設計引物，初步驗證SSR標記的有效性，以期為家蠶品種鑒定提供有效的分子標記工具。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年6月將家蠶品種‘東肥‘彩3‘彩4‘菁松×皓月幼蟲飼養于溫度（25±2）℃、濕度60% ～70%和自然光周期的環境中。7月份解剖‘東肥與‘彩4蠶體（5齡最后一天、預蛹期、排凈糞便），分離得到中腸、脂肪體組織，迅速投入液氮中，保存于-80℃，送北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉錄組測序。

1.2 試驗方法

1.2.1 SSR位點分析 采用MISA程序（1.0版，http：//pgrc.ipkgatersleben.de/misa/misa.html）檢測基因的SSR位點，參數設置默認，1、2、3、4、5、6個unitsize的最少重復次數分別為10、6、5、5、5、5，統計不同SSR類型在轉錄本（Unigene）中的分布規律。

1.2.2 PCR擴增 使用動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，D1700）提取4種家蠶蠶體的DNA，NanoDrop2000檢測DNA濃度和純度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，-20℃保存備用。選擇與家蠶抗氧化途徑相關的、含有SSR位點的重要基因，采用Primer3設計引物。PCR反應體系：DNA0.2μL，引物F、R（10μmol/L）各0.8μL，2×ReactionMix10μL，Taq酶0.4μL，ddH2O8.2μL。擴增程序：94℃ 3min;94℃ 30s，55℃ 30s，72℃1min，35個循環;72℃ 10min。反應結束后，采用2.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3 數據分析

采用MicrosoftExcel2010軟件進行數據統計分析，OriginPro2021b軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 家蠶SSR位點數量與分布

從家蠶的脂肪體和中腸共檢測到1339個SSR位點，分布于960個Unigene，平均每個Unigene含有1.39個SSR位點;192個Unigene含有1個以上SSR位點，SSR發生頻率和出現頻率分別為5.35%、7.47%;每10kb長度序列包含1.53個SSR位點（表1）。SSR位點的基序長度以1bp為主;基序長度為1、3bp時，SSR位點總長度較大;隨著基序長度繼續增加，SSR位點數量大幅減少，位點間的平均距離和平均長度總體呈增加趨勢（表2）。

2.2 家蠶轉錄組SSR位點基序類型

家蠶SSR位點基序類型共有66種，從單核苷酸至六核苷酸均含有多種基序類型。單核苷酸基序類型以A/T為主，占總基序數量的53.10%，C/G基序出現頻率很低;二核苷酸基序類型有8種，以AC/GT為主;三核苷酸基序類型有20種，以CCG/CGG為主;四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸基序類型分別有12、8、14種，分別以AAAT/ATTT、ACAGG/CCTGT、ACCGAG/CGGTCT為主要類型（圖1）。

2.3 家蠶轉錄組SSR位點基序長度分布特征

家蠶轉錄組SSR位點的重復次數與基序類型相關，單核苷酸的重復次數主要范圍為10～17次，二核苷酸的重復次數主要范圍為6～10次，三核苷酸的重復次數主要范圍為5～7次，四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的重復次數以5次為主。SSR位點的重復數主要集中在5～12次，占總SSR位點數的87.60%，其中單核苷酸重復10次的SSR位點最多，共有368個;其次為三核苷酸重復5次，有245個（圖2）。

家蠶轉錄組SSR位點基序長度分布范圍為10～688bp，低度多態性的SSR位點（長度范圍10～11bp）有469個;中度多態性的SSR位點（長度范圍12～19bp）有617個;高度多態性SSR位點（長度≥ 20bp）有253個，占比18.89%（圖3）。

2.4 含有SSR位點的Unigene的GO、KEGG功能注釋

960個Unigene中分別有125、122個在GO、KEGG數據庫中得到功能注釋。GO注釋結果中，分別有47、12、11個Unigene注釋到蛋白結合、DNA結合、核酸結合通路（圖4A）;KEGG注釋結果中，分別有11、10、7、7個Unigene注釋到剪接體、代謝途徑、內吞作用、核糖體生物合成通路（圖4B）。

2.5 SSR引物的有效性與多態性分析

隨機選擇含有不同長度SSR位點的Unigene設計20對引物（表3），以4個家蠶品種進行檢驗，發現19條引物在至少1個家蠶品種中擴增出條帶，7條引物在4個家蠶品種中均擴增出條帶（圖5），說明引物擴增性較好。

3 討論與結論

家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，在基礎研究、應用研究中發揮著重要作用。人工的不斷選育、馴化使家蠶品種多樣、性狀特異，是昆蟲中遺傳資源保存最為豐富的物種之一。前人研究已經證實，微衛星DNA在昆蟲的基因組中廣泛存在。

通過高通量測序獲得的Unigene和SSR位點數量表現出種間特異性。本研究以家蠶中腸、脂肪體轉錄組數據共組裝得到17915條Unigene，其中960個Unigene上共檢測到1339個SSR位點。意大利蜜蜂幼蟲腸道轉錄組測序共獲得12115條Unigene，其中2149條Unigene上分布6312個SSR位點[13]。麥紅吸漿蟲唾腺轉錄組數據只組裝得到1047條Unigene，檢索到141個SSR位點[14]。SSR位點基序類型重復次數的多少與軟件種類、軟件設置、物種、樣品類型有關。常用的SSR位點檢測軟件有MISA、MSATCOMMANDER等。本研究中使用MISA軟件檢測家蠶SSR位點，檢測條件設置從單核苷酸至六核苷酸，單核苷酸的重復次數最多。當MISA軟件設置只檢測二核苷酸至六核苷酸時，意大利蜜蜂幼蟲腸道轉錄組中二核苷酸SSR位點重復次數最多[13]。即使設置條件一致，軟件、物種不同，重復次數最多的SSR位點基序類型也不相同，MSATCOMMANDER軟件檢測桔小實蠅轉錄組測序數據，發現三核苷酸SSR位點重復次數最多[15]。

許多昆蟲轉錄組SSR位點研究表明，單核苷酸重復是占比最高的重復類型。通常來說，A/T既是單核苷酸重復中的優勢類型，也是所有重復類型的優勢類型，但所占比例因物種不同而不同。家蠶中腸、脂肪體SSR位點基序A/T類型占總基序數量的53.10%;梨小食心蟲幼蟲中腸轉錄組中A/T出現頻率可達79.82%[16];在窄足真蚋中則高達86.93%[17];麥紅吸漿蟲唾腺轉錄組數據中A/T只占31.21%[14]。本研究發現家蠶中腸、脂肪體中三核苷酸重復是僅次于單核苷酸重復的類型，占比27.56%，這可能與三核苷酸更容易留在編碼區并且不會引起編碼框移碼有關[18]。

在雙翅目昆蟲中，AC/GT是二核苷酸優勢重復類型[17]。鱗翅目中的粘蟲[19]、小菜蛾、煙草天蛾、棉鈴蟲[20]的二核苷酸優勢重復類型也是AC/GT，與本研究結果一致;印度谷螟[21]、帝王蝶、菜粉蝶[19]則是AT/AT。說明，鱗翅目昆蟲的二核苷酸優勢重復類型與物種相關，沒有表現出明顯的分類學層面特征。

雖然轉錄組測序技術開發的SSR多態性通常低于基因組SSR，但其成本更低、技術成熟，更容易開發大量可用的SSR分子標記。本研究隨機選擇了20對引物，對4種家蠶進行了種間檢測與驗證，初步證實這些引物擴增性較好，為下一步大規模開發SSR分子標記奠定了基礎。