蘭花病毒檢測與脫毒技術研究進展

黎文敏 薛銘 謝利 郭和蓉 張志勝 曾瑞珍

摘要 蘭花病毒病是制約蘭花產業發展的重要因素，其中由建蘭花葉病毒（cymbidium mosaic virus，CymMV）和齒蘭環斑病毒（odontolossum ring spot virus，ORSV）引起的病毒病在全球范圍內影響廣泛且危害嚴重。目前蘭花病毒病尚無特效藥可以防治，加強檢疫、及時銷毀染病植株以及采用無病毒種苗是病毒病防治的有效措施。因此，對引起蘭花病毒病的主要病毒、病毒檢測方法和脫毒技術研究進展進行綜述，以期為蘭花脫毒技術的深入研究和脫毒苗工廠化生產提供參考。

關鍵詞 蘭花;CymMV;ORSV;檢測方法;脫毒技術

中圖分類號 S 436.8? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）03-0008-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.002

Research Progress on Technology of Virus Detection and Virus-removing in Orchids

LI Wen-min， XUE Min， XIE Li et al

（College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642）

Abstract Orchid virus disease is an important factor restricting the development of orchid industry， among which causing by Cymbidium mosaic virus （CymMV） and Odontoglossum ring spot virus （ORSV） are widespread and harmful orchid virus diseases in the world. At present， there are no chemical pesticides for effective prevention and control of the diseases， therefore， strengthening quarantine of the viruses， destroying infected plants in time and adopting virus-free seedlings for cultivation are effective prevention and control measures in production. Therefore， focuses on advancements on the kinds of orchid viruses identified， the technologies of detection and virus-removing of the main virus in orchid， in order to provide reference for further studying on virus-removing techniques and production of virus-free seedling in orchid.

Key words Orchid;CymMV;ORSV;Detection method;Virus-removing technology

基金項目 廣州市農業農村局項目（19100210，20101396 ）; 廣東省現代農業產業技術體系花卉創新團隊項目 （2021KJ121 ）;清遠市科技計劃項目（2021DZX021）;英德市科技計劃項目（英科字〔2021〕19號-10）。

作者簡介 黎文敏（1997—），女，廣西梧州人，碩士研究生，研究方向：花卉遺傳育種。通信作者，副研究員，碩士，從事花卉遺傳育種研究。

收稿日期 2021-09-28

蘭花是蘭科植物（Orchidaceae）的總稱，約有763個屬，28 000種[1]。蘭花株型優美、花型獨特、花期多樣，深受各國人民喜愛，市場前景廣闊。近年來，隨著國內外貿易和種質資源交換的增加以及蘭花種植規模的擴大，蘭花病毒病危害日趨嚴重，對蘭花產業發展構成了嚴重威脅[2]。目前，國內外尚無特效藥防治蘭花病毒病，加強檢疫、及時銷毀染病植株和采用無病毒種苗生產是減少病毒病發生和危害的有效措施[3-4]。該研究綜述侵染蘭花的主要病毒、病毒檢測方法和脫毒苗生產技術，對未來脫毒技術的研究和應用進行了討論，以期為更好開展蘭花脫毒苗生產，促進蘭花產業發展提供參考。

1 侵染蘭花的主要病毒

1943年，澳大利亞Magee首次報道了建蘭上的一種“黑病”，后被證實為建蘭花葉病毒（cymbidium mosaic virus，CymMV）引起的病毒病[5-6]。此后，國內外關于引起蘭花病毒病的病毒種類報道逐漸增多。據Lee等[7]統計，全球范圍內能侵染蘭花的病毒有57種，主要包括齒蘭環斑病毒（ORSV）、建蘭花葉病毒（CymMV）、辣椒褪綠病毒（capsicum chlorosis virus，CaCV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、鳳仙花壞死斑病毒（impatiens necrotic spot virus，INSV）、蘭花斑點病毒（orchid fleck virus，OFV）、落葵皺紋花葉病毒（basella rugose mosaic virus，BaRMV）、菜豆黃花葉病毒（bean yellow mosaic virus，BYMV）、煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）等。

建蘭花葉病毒（CymMV）和齒蘭環斑病毒（ORSV）是世界范圍內對蘭花影響廣泛、造成經濟損失嚴重的2種蘭花病毒[1，8]。建蘭花葉病毒（CymMV）屬于馬鈴薯X病毒屬（Potexvirus），病毒顆粒呈線狀，能使建蘭葉子表面產生褪綠色斑點和局部壞死斑、樹蘭（Epidendrum）產生花葉癥，卡特蘭（Cattleya）產生局部壞死等[9]。齒蘭環斑病毒（ORSV）屬于煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），病毒顆粒呈直桿狀，侵染蘭花后的主要癥狀表現為葉子表面出現黃化條紋或不規則褪綠斑塊、壞死斑、黑斑等，黃化部位有時出現凹陷，有些花朵上產生褪色斑、花朵畸形等[10]。肖火根等[11]在感病的墨蘭（Cymbidium sinense）、文心蘭（Oncidium）、大花蕙蘭（Cymbidium hybridum）等蘭花樣品中檢出CymMV與ORSV。丁元明等[12]從云南省蘭花基地可疑感病蘭株中檢測出CymMV和INSV復合感染。Sudha 等[13]在萬代蘭（Vanda）中檢測出CymMV、ORSV、番茄斑點枯萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）和Poty virus復合感染。說明多種病毒可以同時侵染蘭花，這種復合感染比單一病毒感染危害更嚴重，可導致葉片壞死或產生壞死斑，花朵畸形或花瓣碎色，植株矮小、黃化或萎蔫等。

2 蘭花病毒檢測技術研究進展

病毒檢測是蘭花脫毒苗生產和病毒病防控的關鍵環節之一[14]。早期病毒病診斷采用癥狀觀察法[15]，目前在蘭花生產依然采用該方法初步判別蘭花是否感染病毒，但由于蘭花品種多，癥狀表現影響因素多，有時存在隱癥及多重感染等現象，因此該方法較難對侵染病毒進行精確鑒定。為了更快、更準確、更簡便地對蘭花病毒進行鑒定，研究者開發出多種病毒檢測方法（表1），主要包括指示植物法[16]、電鏡觀察法[17]、血清學檢測法[18-20]、分子生物學檢測法[21-23]等。采用這些方法可以對CymMV、ORSV、CMV、TMV、BYMV、CaCV、OFV、BaRMV等病毒進行準確檢測[16-23]。

指示植物法是將攜帶有病毒的蘭花汁液通過摩擦接種至特定的指示植物上，通過觀察寄主植物的病癥表現來診斷侵染蘭株病毒種類的方法[16]。指示植物檢測方法是國內外早期檢測蘭花病毒的傳統方法之一，具有操作簡單、成本低的優點，但其對操作環境條件要求嚴格，檢測速度慢，顯癥時間長，常與其他檢測方法配合使用[30]。

電鏡檢測法通過觀察植物病毒顆粒大小、形狀、內含體組成和染色組織超微結構等方面的特征來鑒定病毒種類的方法[17]。該方法檢測速度較快，準確性比指示植物法高，但由于該方法制片過程復雜，儀器設備和人員技術要求高，不適用于大批量檢測[17]。近幾年，國內在生產中較少使用該方法，國外常與其他檢測方法配合使用進行少量樣本檢測[31-32]。

血清學檢測法是利用病毒蛋白與特異性抗體相結合的原理對病毒進行檢測的方法[18-20]，主要包括酶聯免疫吸附檢測法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[33]、快速免疫濾紙測定法（rapid immunofilter paper assay，RIPA）[34]、免疫毛細區帶電泳法（immuno-capillary zone electrophoresis，I-CZE）[35]和免疫膠體金技術[36-37]。其中酶聯免疫吸附檢測法（ELISA）是血清學中應用最廣泛的檢測方法，為了縮短檢測時間、提高檢測的準確性和靈敏度，研究者以ELISA為基礎開發出了雙抗體夾心酶聯免疫（DAS-ELISA）[36，38]、斑點酶聯免疫（Dot-ELISA）[39]和三抗體夾心酶聯免疫（TAS-ELISA）等技術[40]。

分子生物學方法是通過檢測病毒核酸來鑒別病毒種類的方法[21-23]，主要包括核酸雜交技術（nucleic acid hybridization）[41]、分子信標技術（molecular beacons）[42]、反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）[43]、環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[44-45]和微陣列芯片檢測技術[46-47]等。其中RT-PCR操作簡便、檢測快速，是分子生物學中應用最廣泛的病毒檢測方法[48]。

為建立更快速、更簡便、特異性和靈敏度更高的蘭花病毒檢測方法，有研究者分別在電鏡技術、血清學和分子生物學等已有的檢測方法基礎上進行創新，建立了液相色譜/質譜聯用（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）和激光解吸-離子化質譜分析法（matrix-assisted laser desorption-ionization，MALDI）[24]、石英晶體微天平（quartz crystal microbalance，QCM）免疫傳感器[25]、磁還原測定法（magnetoreduction assays，MRA）[26]、光學相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）[27]、光纖粒子等離子體共振（fiber optic particle plasmon resonance，FOPPR）免疫傳感器[28]、微/納米混合結構免疫-電化學生物傳感器（micro/nano hybrid-structured immuno-electrochemical biosensor）[29]等檢測新技術，由于這些技術對儀器設備要求高、專業技術性強、迄今并未大量應用于生產實際。

3 蘭花脫毒技術研究進展

自Morel[49]于1960年采用莖尖培養進行蘭花脫毒苗生產以來，蘭花脫毒技術研究取得了明顯進展。迄今為止，已開發出莖尖培養脫毒[49-60]、化學處理脫毒[54-55，61-65]、熱處理脫毒[54-55，66]、病毒A處理結合花梗組織培養脫毒[67]和超低溫處理脫毒[68-70]等技術，建立了卡特蘭、文心蘭、大花蕙蘭、石斛蘭、蝴蝶蘭、雜交蘭、虎雪蘭等蘭花脫毒苗生產技術體系（表2）。

莖尖培養脫毒是根據植物頂端分生組織缺少成熟的維管束與其他部分相連接，從而減緩病毒向頂端移動，導致該部位較少含有或不含病毒，因此通過莖尖培養生產脫毒苗的方法[49-60]。莖尖培養脫毒是蘭花脫毒苗生產中常用的技術，其脫毒效果與蘭花種類、莖尖大小等關系密切。朱根發等[51-52]采用莖尖培養成功生產出文心蘭和大花蕙蘭的無病毒種苗。丁蘭等[56]切取大小為0.40～0.80 mm的蝴蝶蘭莖尖進行培養，其成活率達到67.37%，但沒有培養出完全脫除CymMV和ORSV的脫毒苗。景維杰等[57]研究發現，采用帶1個葉原基，大小為0.20～0.40 mm的蝴蝶蘭莖尖進行培養，能生產出完全脫除CymMV和ORSV的脫毒苗。

化學處理脫毒是將甲基鳥嘌呤、2-硫尿嘧啶、疊氮胸苷、三氮唑核苷、DHT和病毒唑等化學物質加入培養基中或直接處理培養材料，殺死病毒或抑制培養材料內病毒的復制，從而達到脫毒目的的方法[54-55，61-65]?；瘜W處理結合莖尖培養能提高蘭花脫毒率，比單獨使用莖尖培養脫毒效果好，也有研究者同時采用化學處理和熱處理結合莖尖培養進行蘭花病毒的脫除，脫毒率高達100.00%[55]。

熱處理脫毒是應用最早的植物脫毒方法之一，它是利用病毒不耐高溫的特點，通過熱處理使病毒鈍化，從而實現去除植物體內病毒的方法[54-55，66]。Stone[66]研究表明，單一熱處理對脫去蘭花CymMV和ORSV效果不明顯。賀嘉[54]采用38/32 ℃變溫熱處理蝴蝶蘭試管苗35 d，結合2.00 mm莖尖培養進行脫毒，CymMV脫毒率為46.67%。靖晶[55]對蝴蝶蘭試管苗進行 36 ℃ 熱處理15 d后，結合3.00 mm莖尖培養進行脫毒，結果顯示 CymMV與ORSV 的脫毒率均為71.40%。目前對外植體材料進行熱處理后結合莖尖培養已成為蘭花脫毒苗生產的有效方法。

超低溫處理脫毒是近幾年來發展的蘭花脫毒新技術，原理是利用超低溫（-196 ℃）選擇性將病毒殺死，從而脫去植物中的病毒[68-70]。李涵等[68]以攜帶CymMV與ORSV的雜交蘭根狀莖為材料，經過低溫煉苗21 d后，采用包埋玻璃化超低溫保存法結合莖尖培養，成功脫除病毒，脫毒率為100.00%。王玉英等[69]、王仁睿等[70]等應用玻璃化超低溫法對虎雪蘭、蝴蝶蘭進行脫毒培養，成功脫除CymMV與ORSV和CymMV。由于超低溫處理脫毒法對溫度控制要求苛刻，操作繁雜，使用不當容易致死植物，目前尚未在脫毒苗生產中廣泛采用。

4 結語

病毒病是蘭花的“癌癥”，顯著影響蘭花產量和質量，是制約蘭花產業可持續發展的重要因素。蘭花病毒病防控可以采用培育抗病毒品種[1，71]、建立有效防控技術、采用脫毒苗等手段進行。由于病毒變異速度快，而抗病毒品種選育需要時間長，因此目前采用選育抗病品種的方法防控蘭花病毒病在生產實際中應用較少，在沒有有效防治病毒病技術的情況下，采用脫毒苗就成為減少病毒病危害的重要手段。

自20世紀60年代建立蘭花莖端分生組織培養脫毒技術以來，蘭花脫毒技術和病毒檢測方法取得了一定進展，但脫毒苗在蘭花生產上應用并不廣泛，主要原因是脫毒技術難度大，脫毒苗在生產應用中因二次感染導致實際效果不明顯等。因此要推動脫毒苗在生產上的廣泛應用，今后應加強以下幾個方面的研究工作：①進一步加強脫毒技術研究，建立簡便穩定高效的脫毒技術體系，這是生產上利用脫毒苗減少病毒病造成損失的關鍵;②深入研究單一病毒和多種病毒對蘭花的危害，為制定有效脫毒方案提供指導;③建立更多蘭花病毒的檢測和脫毒技術體系，為脫毒苗生產提供技術支撐;④加強防止脫毒苗二次感染技術研究，確保脫毒苗應用的效果。

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