2種羌活藥用植物的葉綠體基因組密碼子使用偏性分析

王琳璇 王高烽 谷威 趙志敏 馬永貴

摘要 對羌活（Notopterygium incisum）與寬葉羌活（N.franchetii）的葉綠體編碼基因的密碼子使用偏性（codon usage bias）及其影響因素進行了分析。結果表明：羌活和寬葉羌活的葉綠體基因組總ENC值分別為49.79和49.70，偏性較弱，密碼子第3位堿基傾向于使用A/T。PR2-plot分析表明，選擇壓力和突變都是影響2種羌活葉綠體密碼子使用偏性的主要因素;而中性繪圖分析和ENC-plot分析表明選擇壓力是影響2種羌活葉綠體密碼子使用偏性的主要因素。相對同義密碼子使用度（RSCU）分析確定了2種羌活中使用頻率較高的30個高頻密碼子，幾乎都以A或U結尾，只有UUG以G結尾。羌活的最優密碼子9個，寬葉羌活的最優密碼子7個。2種羌活有5個最優密碼子相同，分別是UUG、CAU、CGU、AGU、GGA。該研究結果為后續藥用羌活植物的基因表達、蛋白質翻譯和遺傳育種研究提供了研究依據和基礎數據。

關鍵詞 羌活;寬葉羌活;葉綠體基因組;密碼子使用偏性;最優密碼子

中圖分類號 Q 943.2? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）03-0095-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.025

Codon Usage Bias in Chloroplast Genomes of Two Medicinal Species of Notopterygium H. de Boissieu

WANG Lin-xuan， WANG Gao-feng， GU Wei et al

（College of Life Sciences， Qinghai Normal University， Xining， Qinghai 810000）

Abstract This study analyzed the codon usage bias and affecting factors of the protein coding genes （CDS） of the chloroplast genomes of two medicinal plants， Notopterygium incisum and N. franchetii. The results showed that the chloroplast genomes of N. incisum and N. franchetii had a total ENC value of 49.79 and 49.70， respectively， indicating weak codon usage bias. The third base of the codon of the two chloroplast genomes preferred to use A/T. The analysis of PR2-plot showed that selection pressure and nutation were the main factors affecting the bias of codon usage in N. incisum and N. franchetii CDS， while neutrality plot and ENC-plot analyses both illustrated selection pressure was the main factors affecting codon usage bias in the two species. Relative Synonymous Codon Usage （RSCU） analysis determined 30 high-frequency codons used in N. incisum and N. franchetii， almost all ending with A or U， with only UUG ends with G. There were nine optimal codons identified in N. incisum， and seven optimal codons found in N. franchetii. The five optimal codons shared by N. incisum and N. franchetii were namely UUG， CAU， CGU， AGU， GGA. The results provide important basal data for the future study of gene expression， protein translation and molecular breeding of medicinal Notopterygium plants.

Key words Notopterygium incisum;Notopterygium franchetii;Chloroplast genome;Codon usage bias;Optimal codons

基金項目 青海省基礎研究計劃項目（2018-ZJ-741）。

作者簡介 王琳璇（1994—），女，河北廊坊人，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學。

通信作者，教授，博士，從事動植物分子進化與適應研究。

收稿日期 2021-04-03

密碼子在蛋白質合成過程中起著傳遞遺傳信息的關鍵作用，在大多數情況下，編碼同一氨基酸的同一密碼子的使用頻率是不同的，這一現象稱為密碼子使用偏性（codon usage bias）。某一物種或某一基因通常傾向于使用一種或幾種特定的同義密碼子，這些密碼子被稱為最優密碼子（optimal codon）。影響密碼子使用偏性的因素很多，最主要的因素是定向突變和中性選擇[1-3]，還包括GC含量、同義替換率[4]、tRNA豐度[5]、有效翻譯起始位點的選擇[6]、密碼子親水性和DNA復制起始位點[7]、基因長度[8]和表達水平[9]等。在不同物種中，突變和選擇的影響強度不同。例如在藍藻中，影響密碼子使用偏性較大的是GC組成與選擇壓力[10]，但在果蠅中則是突變對的密碼子使用偏性影響較大[3]。

葉綠體是植物進行光合作用的器官，也參與到植物的氨基酸合成等通路中。作為植物重要的細胞器，葉綠體有自己一套獨特的遺傳信息[11]。針對葉綠體基因組的密碼子使用偏性研究，可以幫助了解葉綠體蛋白質編碼基因的使用偏好，為后續遺傳改造和基因表達研究提供基礎數據。研究發現，乳油木葉綠體基因組密碼子使用偏性更多受突變影響[12]，選擇壓力對其使用偏性影響較小。杜梨葉綠體密碼子使用偏性則主要受選擇的影響[13]。胡曉艷等[14]在對酸棗葉綠體基因組的研究中獲得了7個最優密碼子。

羌活屬（Notopterygium Boissieu）植物隸屬于傘形科（Apiaceae）美味芹族，是我國特有的多年生草本藥用植物，主要分布在我國西南部高山地區[15]。據《中國植物志（英文版）》記載，該屬包括寬葉羌活、羌活、羽苞羌活、瀾滄羌活、卵葉羌活和細葉羌活6個種[16]?！吨袊幍洹芬幎ǖ那蓟罨粗参餅榍蓟钆c寬葉羌活，入藥部位為干燥根及根莖，具有解表散寒、祛風除濕和止痛的功效。羌活主要產于四川、云南，次產于青海及甘肅;寬葉羌活主產于甘肅、青海，次產于四川、山西和內蒙古等地。近年來，由于過度采挖及生境受到嚴重破壞，野生羌活的自然群體已經面臨瀕危，被載入《中國生物多樣性紅色名錄（高等植物卷）》[17]。羌活作為一味傳統的中藥，富含異歐芹素、羌活醇、阿魏酸等活性物質，具有抗炎、抗氧化、抗心律失常、抗菌、抗癌細胞增殖等藥效作用[18]。目前有關羌活屬葉綠體基因組密碼子使用偏性研究鮮見報道。該研究擬對2種可以入藥的羌活屬植物，即羌活和寬葉羌活進行葉綠體基因組的密碼子使用模式分析，研究結果不但可以闡明羌活光合作用相關基因的使用偏好，也可為羌活基因表達研究及遺傳育種研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數據獲取

羌活樣品采集于青海省果洛藏族自治州達日縣，99.46° E，33.77° N，海拔3 943.24 m。寬葉羌活樣品采自青海省瑪可河麥浪溝，100.96° E，32.84° N，海拔3 790.78 m。保存于干冰中，送于北京百邁客生物科技有限公司進行葉綠體基因組測序。利用Illumina HiSeq X Ten 平臺測序，使用MIRA序列組裝軟件的MIRA v3.4.1.1模塊進行，最終得到羌活的葉綠體全基因組序列長度為 157 050 bp。寬葉羌活的葉綠體全基因組序列長度為 142 184 bp。測序結果提交至NCBI（national center for biotechnology information），登錄號：羌活MW820163、寬葉羌活MW820162。使用Geneious11.1.5 提取編碼基因（coding sequence，CDS）并篩選，剔除小于300 bp的基因，并選擇起始密碼子為ATG的編碼基因進行后續分析，最終羌活獲得51條編碼基因，寬葉羌活獲得50條編碼基因。

1.2 分析方法

1.2.1 密碼子相關參數計算。

使用軟件codonW1.4.2分析獲得的編碼基因，計算有效密碼子數（effective number of codon，ENC）。ENC范圍一般在20～61，越接近20，表示密碼子使用偏性越大。使用在線分析軟件CUSP（http：//embossgui.sourceforge.net/demo/）對葉綠體基因組密碼子的GC含量等堿基組成信息進行研究，并對相關參數進行相關性分析[19]。

1.2.2 中性繪圖分析。

分別以CGC1、CGC2、CGC3表示密碼子第1、2、3位的GC含量，CGC12表示CGC1與CGC2的平均數，以CGC3和CGC12為橫、縱坐標繪制散點圖，分析葉綠體基因組密碼子第3位和前2位的相關性，從而分析影響密碼子偏性的因素[20]。以CGC3、CGC12為橫、縱坐標繪制散點圖，如果CGC3和CGC12呈顯著相關，說明密碼子第3位的堿基組成與前2位相似，密碼子偏性主要受突變的影響;如果CGC3和CGC12無顯著相關關系，趨勢線斜率接近0，則說明密碼子第3位與前2位堿基組成差異較大，密碼子堿基相對保守，這種情況密碼子偏性更多受選擇的影響[21]。

1.2.3 PR2-plot繪圖分析。

為進一步分析影響2種羌活葉綠體基因組密碼子偏性的因素，以CA3、CT3、CC3、CG3分別表示密碼子第3位A、T、C、G 4種堿基的含量，以CG3/（CG3+CC3）為橫坐標，CA3/（CA3+CT3）為縱坐標繪制散點圖。如果大部分基因分布在圖像上半部，說明密碼子第3位堿基含量A>T，反之則T>A，同理如果大部分基因分布在圖像右半部，說明密碼子第3位堿基含量G>C，反之則C>G。若點在圖中均勻分布，則密碼子偏性完全受突變影響[20-21]。

1.2.4 ENC-plot繪圖分析。

以GC3為橫坐標，以ENC值為縱坐標繪制散點圖，并以ENC期望繪制標準曲線。

ENC期望=2+CGC32+29CGC32+（1-CGC3）2

標準曲線表示在無選擇壓力的情況下ENC與CGC3的關系，如果點主要分布于曲線附近，說明密碼子偏性更多受突變的影響，如果點分布于距標準曲線較遠的位置，則說明密碼子偏性更多受選擇的影響。根據公式（ENC期望-ENC實際）/ENC期望制作ENC分布頻數表，統計ENC實際與ENC期望的差距[22]。

1.2.5 RSCU分析。

使用CodonW計算2種羌活葉綠體基因組的RSCU（relative synonymous codon usage）。RSCU是實際觀察到的某密碼子使用頻率與預期（該密碼子編碼的氨基酸的同義密碼子使用頻率相等時）使用頻率的比值。理論值與預期值相等時，密碼子不存在偏性。所以當RSCU=1.00，表明密碼子使用無偏性;RSCU>1.00時，表明該密碼子實際使用頻率較高;RSCU<1.00時，表明實際使用頻率較低[23]。

1.2.6 最優密碼子分析。

選出2種羌活葉綠體編碼基因密碼子ENC值最大的10%和最小的10%，分別建立高低表達庫，選出庫中ΔRSCU>0.08且整體RSCU>1.00的密碼子[24]。

2 結果與分析

2.1 密碼子組成

2種羌活葉綠體基因組密碼子第3位的堿基組成結果顯示，羌活的葉綠體基因組密碼子第3位的CA3、CT3分別為42.75%與46.97%（表1），明顯高于CC3、CG3，說明羌活葉綠體基因組密碼子多以AT結尾;寬葉羌活的密碼子第3位堿基組成與羌活類似，AT含量較高。 羌活與寬葉羌活的葉綠體密碼子第1位GC含量從第1位到第3位逐漸下降，第1位分別為46.16%、45.99%，第2位38.17%、37.91%，第3位29.97%、29.67%。2種羌活的ENC均大于49.00，說明2種羌活葉綠體基因組密碼子偏性較弱。

使用CUSP統計2種羌活葉綠體基因組編碼基因的CGC、CGC1、CGC2、CGC3、ENC，結果表明，羌活和寬葉羌活的葉綠體基因組編碼基因的CGC平均值為38.64%和38.44%（表2），差異不大。羌活和寬葉羌活中CGC最高的基因皆為rps11，CGC最低的基因為ycf1。羌活和寬葉羌活編碼基因的ENC值范圍分別是36.33～55.03、37.97～57.09，而且羌活約有83%編碼基因的ENC值大于45.00，寬葉羌活有79%編碼基因的ENC值大于45.00，說明多數編碼基因密碼子使用偏性較弱。2種羌活的rps8的ENC值最小，分別為36.33和37.97，表明rps8在2種羌活葉綠體編碼基因中偏性最強。

對2種羌活的葉綠體編碼基因的CGC1、CGC2、CGC3、GC、ENC、葉綠體編碼基因序列長度（sequence length，SL）等參數進行相關性分析，結果表明2種羌活的堿基組成相關性較接近，CGC1與CGC2皆為極顯著相關（表3），且CGC1、CGC2都與CGC3無顯著相關性;2種羌活的GC含量與第1、2、3位組成均極顯著相關。羌活與寬葉羌活的SL與CGC1、CGC2、CGC3、GC、ENC均無顯著相關性。2種羌活的相關性分析結果也存在一定差異，羌活的ENC與CGC3極顯著相關，而寬葉羌活的ENC除了與CGC3極顯著相關外，還與GC顯著相關。

2.2 中性繪圖分析

羌活的CGC12取值范圍為 0.324～0.550（圖1），CGC3與CGC12的回歸系數為0.218 7，皮爾森系數為0.147，無顯著相關性，說明羌活的葉綠體密碼子第3位堿基組成與第1、2位差異較大，密碼子偏性主要受選擇的影響。寬葉羌活的CGC12的取值范圍0.321～0.547（圖1），CGC3與CGC12的回歸系數為0.431 7，皮爾森系數為0.316，相關性較低，說明寬葉羌活的葉綠體密碼子第3位堿基組成與第1、2位差異較大，密碼子偏性受選擇影響較大。

2.3 PR2-plot分析

PR2-plot分析以CG3/（CG3+CC3）為橫坐標，CA3/（CA3+CT3）為縱坐標繪制散點圖，結果表明，2種羌活大部分基因分布在右下方位置（圖2），說明羌活和寬葉羌活的葉綠體基因組密碼子不僅受到突變的影響，還受到選擇的影響，并且密碼子第3位的堿基頻率T>A，G>C。

2.4 ENC-plot分析

對2種羌活進行ENC-plot繪圖分析，結果見圖3。標準曲線表示在無選擇壓力的情況下，ENC與CGC3的關系。如果點主要分布于曲線附近，說明密碼子偏

性更多受突變的影響，如果點分布于距標準曲線較遠的位置，說明密碼子偏性更多受選擇的影響。2種羌活的編碼基因在標準曲線兩側均有基因分布，大部分基因位于標準曲線下側，部分基因距標準曲線較遠。

為了進一步分析ENC實際值與標準曲線的偏離情況，制作ENC分布頻數表，結果見表4，羌活有24個基因的比值在-0.05～<0.05，表明有24個基因的ENC實際值與期望值接近（ENC比值-0.05～<0.05），其余27個基因的ENC實際值與期望值相差較大（ENC比值>0.05或<-0.05），其中psbA、rps8、rp116、petD、psbC、psbD、petB的ENC實際值距標準曲線較遠（ENC比值>0.15）。寬葉羌活有23個基因的比值在-0.05～<0.05，ENC實際值與期望值接近，27個基因ENC實際值與期望值差距較大，其中rps8、petB、petD、psbC、ndhE、ndhI的ENC實際值距標準曲線較遠。說明2種羌活的葉綠體基因組密碼子偏性受突變的影響較小，更多受選擇的影響。

2.5 RSCU分析

由表5可知，羌活和寬葉羌活各有30個密碼子RSCU>1.00，說明各有30個密碼子的使用有偏好性。實際使用頻率偏高（RSCU>1.00）的密碼子中結尾為U的有16個，結尾為A的有13個，只有UUG以G結尾。說明2種羌活葉綠體基因組密碼子偏好以A、U結尾，其中U的偏好性略強于A。

2.6 最優密碼子確定

2種羌活的最優密碼子均符合總RSCU>1.00，ΔRSCU≥0.08。2種羌活的最優密碼子都多以A/U結尾，只有UUG以G結尾。確認了羌活的最優密碼子9個（UUG、CUU、ACU、UAU、CAU、AAU、CGU、AGU、GGA），寬葉羌活的最優密碼子7個（UUG、CCA、CAU、CGU、AGU、AGA、GGA）。2種羌活有5個最優密碼子相同，分別是UUG、CAU、CGU、AGU、GGA（表6）。

3 討論

該研究對羌活和寬葉羌活基因組密碼子使用偏好性及其主要影響因素進行了探討和比較。結果表明，ENC小于45的基因較少，多數基因ENC較高，說明2種羌活基因組密碼子使用偏性均較弱。相關性分析結果表明，2種羌活的葉綠體基因組ENC都與CGC3顯著相關，說明密碼子第3位堿基組成對密碼子偏性的影響較大，這與原曉龍等[25]對云南藍果樹的研究結論一致。而尹為治等[26]研究結果表明，坡壘的葉綠體基因組密碼子第1位堿基組成對密碼子偏性的影響更大。密碼子組成分析顯示，2種羌活的總GC和CGC3較低，且CGC1>CGC2>CGC3，密碼子的第3位傾向于使用A/T，第3位堿基使用頻率T>A，G>C。

突變和選擇壓力是2個影響密碼子偏性的主要因素。PR2-plot分析結果發現，基因分布在圖中發生了偏移，可知2種羌活的葉綠體密碼子使用偏性不僅受到了突變的影響，還受到了選擇壓力的影響。中性繪圖結果顯示，2種羌活CGC12與CGC3相關性不顯著，說明密碼子第3位的堿基組成與前兩位差異大，密碼子相對保守，表明選擇壓力對密碼子的影響較大。ENC-plot結果顯示，2種羌活的多數葉綠體基因偏離標準曲線進一步證實選擇壓力是影響2種羌活葉綠體密碼子使用偏性的主要因素。綜上所述，2種羌活的葉綠體基因組密碼子使用偏性受到突變和選擇壓力的影響，最主要的影響因素是選擇壓力。影響竹亞科的巴山木竹、印度簕竹、Olyra latifolia L.以及苦蕎的葉綠體基因組密碼子使用偏性的主要因素也是選擇壓力[27-28]。而突變對槲蕨屬的川滇槲蕨、櫟葉槲蕨的葉綠體基因組密碼子使用偏性的影響更大[29]。

羌活和寬葉羌活的葉綠體基因組密碼子使用模式較為相似。2種羌活的總GC含量與密碼子各位的GC含量差異不大;葉綠體基因組密碼子偏性都較弱;密碼子第3位都傾向于使用A/T，且堿基含量T>A，G>C;影響密碼子使用偏性的主要因素都是選擇壓力。

通過RSCU分析，確定了2種羌活中使用頻率較高的30個高頻密碼子（RSCU>1.00），幾乎都以A或U結尾，只有UUG以G結尾。確認了羌活的最優密碼子9個（UUG、CUU、ACU、UAU、CAU、AAU、CGU、AGU、GGA），寬葉羌活的最優密碼子7個（UUG、CCA、CAU、CGU、AGU、AGA、GGA）。2種羌活有5個最優密碼子相同，分別是UUG、CAU、CGU、AGU、GGA。

該研究通過對2種羌活藥用植物的葉綠體基因組編碼基因的使用偏性進行比較分析，得出主要結論：①2種藥用羌活葉綠體基因組的密碼子使用偏性整體較為相似，且偏性較弱;②密碼子的第3位傾向于使用A、T;③突變和選擇壓力在2種羌活的密碼子使用偏性中起主要作用，其中選擇壓力對密碼子使用偏性影響更大。該研究結果為后續藥用羌活植物的基因表達、蛋白質翻譯和遺傳育種研究提供了研究依據和基礎數據，有潛在的經濟價值和應用價值。

參考文獻

[1] MARAIS G，MOUCHIROUD D，DURET L.Neutral effect of recombination on base composition in Drosophila[J].Genetical research，2003，81（2）：79-87.

[2] PRABHA R，SINGH D P，SINHA S，et al.Genome-wide comparative analysis of codon usage bias and codon context patterns among cyanobacterial genomes[J].Marine genomics，2017，32：31-39.

[3] VICARIO S，MORIYAMA E N，POWELL J R.Codon usage in twelve species of Drosophila[J].BMC evolutionary biology，2007，7：1-17.

[4] SHARP P M，LI W H.The rate of synonymous substitution in enterobacterial genes is inversely related to codon usage bias[J].Molecular biology and evolution，1987，4（3）：222-230.

[5] OLEJNICZAK M，UHLENBECK O C.tRNA residues that have coevolved with their anticodon to ensure uniform and accurate codon recognition[J].Biochimie，2006，88（8）：943-950.

[6] ZALUCKI Y M，POWER P M，JENNINGS M P.Selection for efficient translation initiation biases codon usage at second amino acid position in secretory proteins[J].Nucleic acids research，2007，35（17）：5748-5754.

[7] HUANG Y，KOONIN E V，LIPMAN D J，et al.Selection for minimization of translational frameshifting errors as a factor in the evolution of codon usage[J].Nucleic acids research，2009，37（20）：6799-6810.

[8] 孫錚，馬亮，MURPHY R，等.Wolbachia pipientis wMel 基因組水平上的密碼子使用分析[J].中國科學（C輯：生命科學），2009，39（10）：948-953.

[9] HIRAOKA Y，KAWAMATA K，HARAGUCHI T，et al.Codon usage bias is correlated with gene expression levels in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe[J].Genes to cells，2009，14（4）：499-509.

[10] SUBRAMANIAN S.Nearly neutrality and the evolution of codon usage bias in eukaryotic genomes[J].Genetics，2008，178（4）：2429-2432.

[11] 黃瓊林.高良姜葉綠體基因組測序與特征分析[J].熱帶作物學報，2021，42（1）：1-6.

[12] 原曉龍，李云琴，張勁峰，等.乳油木葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J].分子植物育種，2020，18（17）：5658-5664.

[13] 辛雅萱，董章宏，瞿紹宏，等.杜梨葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J].河北農業大學學報，2020，43（6）：51-59.

[14] 胡曉艷，許艷秋，韓有志，等.酸棗葉綠體基因組密碼子使用偏性分析[J].森林與環境學報，2019，39（6）：621-628.

[15] 劉文武，蔣曉文，張帥，等.羌活中香豆素類化學成分及其抗氧化活性研究[J].中草藥，2019，50（6）：1310-1315.

[16] 楊嬌.羌活屬葉綠體基因組進化及物種界定研究[D].西安：西北大學，2018：5-6.

[17] 閻夢穎.珍稀瀕危羌活屬藥用植物的譜系地理學研究[D].西安：西北大學，2016：5-6.

[18] 郭培，郎擁軍，張國桃.羌活化學成分及藥理活性研究進展[J].中成藥，2019，41（10）：2445-2459.

[19] 趙森，鄧力華，陳芬.秋茄葉綠體基因組密碼子使用偏好性分析[J].森林與環境學報，2020，40（5）：534-541.

[20] 吳憲明，吳松鋒，任大明，等.密碼子偏性的分析方法及相關研究進展[J].遺傳，2007，29（4）：420-426.

[21] 尚明照，劉方，華金平，等.陸地棉葉綠體基因組密碼子使用偏性的分析[J].中國農業科學，2011，44（2）：245-253.

[22] WRIGHT F.The‘effective number of codons’used in a gene[J].Gene，1990，87（1）：23-29.

[23] SHARP P M，LI W H.The codon Adaptation Index—A measure of directional synonymous codon usage bias，and its potential applications[J].Nucleic Acids Res，1987，15（3）：1281-1295.

[24] 陸奇豐，駱文華，黃至歡.兩種梧桐葉綠體基因組密碼子使用偏性分析[J].廣西植物，2020，40（2）：173-183.

[25] 原曉龍，康洪梅，王毅.云南藍果樹葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J].西北林學院學報，2020，35（4）：26-31，124.

[26] 尹為治，方正，黃良鴻，等.海南2種龍腦香科植物葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J].林業調查規劃，2020，45（6）：19-26.

[27] 吳妙麗，陳世品，陳輝.竹亞科葉綠體基因組的密碼子使用偏性分析[J].森林與環境學報，2019，39（1）：9-14.

[28] 胡莎莎，羅洪，吳琦，等.苦蕎葉綠體基因組密碼子偏愛性分析[J].分子植物育種，2016，14（2）：309-317.

[29] 沈宗芳，陸添權，張志榮，等.槲蕨屬葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J].廣西植物，2021，41（2）：266-273.