地諾單抗生物類似藥的N-糖型優化

殷龍 賈艷麗 姚月琴 張儉 譚小釘

摘 要 目的：使用糖型調節試劑優化地諾單抗（denosumab）生物類似藥的N-糖基化修飾，使其主要糖型G0F和G1F的比例與地諾單抗高度類似。方法：利用單因素和DOE試驗方法，考察不同濃度氯化錳、半乳糖及尿苷對地諾單抗生物類似藥糖基化修飾的影響。結果：經過單因素試驗、DOE分析及200 L細胞培養工藝放大，確定糖型調節劑氯化錳和半乳糖的最佳用量分別是150 mmol/L和35.56 mmol/L。結論：使用糖型調節劑氯化錳和半乳糖能有效調節地諾單抗生物類似藥的糖基化修飾比例，可為其他單抗生物類似藥生產工藝的優化提供借鑒。

關鍵詞 生物類似藥 糖基化 細胞培養

中圖分類號：TQ460.62； TQ464.7 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2022）03-0077-05

N-glycosylation optimization for biosimilar denosumab

YIN Long， JIA Yanli， YAO Yueqin， ZHANG Jian， TAN Xiaoding

（Jiangsu Mabwell Health Pharmaceutical R&D Co.， Ltd.， Taizhou 225300， China）

ABSTRACT Objective： To optimize the N-glycosylation of denosumab biosimilar using some glycosylation reagents so as to make the proportion of G0F and G1F be highly similar to denosumab. Methods： The effects of the different concentrations of manganese chloride、galactose and uridine on the glycosylation of denosumab biosimilar were studied by single factor and DOE assays. Results： A preferred combination including manganese chloride 150 mmol/L， galactose 35.56 mmol/L was obtained by single factor test， DOE analysis and 200 L cell cultivation. Conclusion： The use of manganese chloride and galactose can effectively regulate the glycosylation modification ratio of denosumab biosimilar， which can provide a reference for the optimization of production process of the other mono-cloning antibody biosimilars.

KEy wORDS biosimilar； glycosylation； cell culture

抗體藥物屬于生物大分子藥物，其生物功能的發揮離不開復雜的翻譯后修飾。糖基化（glycosylation）作為抗體最重要的翻譯后修飾，是指蛋白質或脂質在酶的作用下連接上糖鏈的過程，其對抗體的生物活性和體內代謝有著重要的作用[1]，不同的糖基化對抗體親和力和體內代謝具有顯著影響[2-4]?？贵w藥物中常見的糖型有巖藻糖（Fuc）、半乳糖（Gal）、唾液酸（Sia）和甘露糖（Man）修飾，不同比例的糖型修飾可影響抗體藥物的穩定性、電荷異構、生物學活性等，如巖藻糖修飾影響單抗的抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）[5-6]；高甘露糖修飾可縮短藥物的半衰期[7]；半乳糖修飾可提高抗體與補體的親和力、增強補體依賴的細胞毒性（complement-dependent cytotoxicity，CDC）效應[8]。因此，糖基化修飾通常作為抗體藥物生產過程中的關鍵質量屬性（critical quality attributes，CQA）進行調控[9]。

地諾單抗糖基化形式為N-糖基化。N-糖基化是在內質網上由糖基轉移酶催化、在內分泌蛋白和膜結合蛋白的天冬酰氨殘基的氨基上結合寡糖的過程，寡糖中的乙酰葡萄糖與多肽鏈中天冬酰胺殘基的酰胺氮連接形成N-連接糖蛋白。N-糖基化的位點是Asn-X-Thr/Ser（其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸）3個氨基酸殘基組成的序列段[10-11]。單克隆抗體糖基化類型主要有G0、G0F、G1F、G2F、Man5等[1]，地諾單抗的糖基化類型以G0F和G1F為主，所占比例分別約為62%和20%；本研究中的單抗為地諾單抗生物類似藥，其糖基化類型以G0F為主，所占比例約為80%。糖基化修飾的差異可能導致藥物結合活性、半衰期等差異，從而影響藥效，考慮到生物類似藥用藥的安全性，需將糖型優化至與地諾單抗高度類似。

糖型調節是生物藥工藝研發過程中常遇到的工藝難題，影響單克隆抗體糖基化類型及比例的因素有很多，如細胞株、培養方式、培養參數控制等[1，12-16] ，在細胞株構建和篩選過程中，可通過基因改造等方式進行糖基化優化，如利用基因敲除降低巖藻糖基化比例從而增強抗體的ADCC效應；在細胞培養工藝中可通過改變細胞培養過程中培養基的糖分、金屬離子濃度等條件來改變蛋白質的糖基化類型及比例。細胞株構建雖然能從根本上決定糖型的類型與比例，但通過細胞株改造進行糖型調節耗時、耗力，并不適用于生物類似藥的工藝優化。通過培養基成分的調節及控制參數優化是常見的優化方式，但細胞培養方式和控制參數對糖基化的影響通常是多因素交互作用的，在工藝開發過程中需要考慮工藝控制的可操作性和精確性；另外，在糖型優化過程中不僅需要選擇合適的糖型調節試劑，還需要兼顧同一試劑對不同糖型的影響程度和影響趨勢，以及產品本身的其它關鍵質量屬性，如電荷異構體、蛋白純度等；同時，不同培養規模條件下細胞生長環境的變化、不同反應器控制策略的差異導致細胞培養過程對糖型調節試劑需求有所差異，因此工藝放大過程可能帶來的結果差異也需要特別關注。

本研究選擇氯化錳、半乳糖和尿苷作為糖型調節劑，先采用單因素方法測試三種糖型調節劑的效果，再采用實驗設計（design of experiment，DOE）的方法找到合適劑量，并將優化后培養工藝放大到中試規模確證，確保優化后糖型可達到與原研藥高度類似的效果，且對抗體的其他質量屬性無明顯影響。

1.1 實驗材料

表達地諾單抗生物類似物的重組細胞為中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞，培養基為CD CHO（Gibco公司）；地諾單抗對照抗體采購于市售藥物；糖型調節劑為氯化錳、尿苷（Sigma公司）、半乳糖（Pfanstiehl公司）。

1.2 細胞培養

1.2.1 搖瓶培養

從細胞庫取出CHO細胞種子，在搖瓶上逐步擴大培養體積制備實驗用種子細胞，培養條件為36.8 ℃、5% CO2、搖床轉速120 r/min；采用分批補料（fed-batch）培養方式進行抗體制備，d 0～5培養溫度為36.8 ℃、d 6降溫至33 ℃，培養時間為14 d，培養過程中監測細胞生長和活率。

1.2.2 生物反應器培養

200 L規模培養工藝采用XDR 200反應器（Cytiva公司）、分批補料培養方式，d 0～5培養溫度36.8 ℃、d 6降溫至33 ℃，培養過程中控制pH 6.95、溶氧40%、攪拌轉速100 r/min、培養時間14 d，監測細胞生長和活率。優化前工藝不添加任何糖型調節劑。

1.3 糖型優化方法

1.3.1 單因素

采用搖瓶培養對氯化錳、半乳糖和尿苷三種糖型調劑進行單因素實驗，每個糖型調節劑設置3個濃度水平，氯化錳測試濃度為154、308和616 μmol/L；半乳糖測試濃度為15.4、30.8和61.6 mmol/L；尿苷測試濃度為1.65、3.3和6.6 mmol/L。

1.3.2 多因素DOE析因糖型優化

根據單因素試驗的結果確定選擇氯化錳和半乳糖作為糖型調節劑，進行2因素2水平DOE析因糖型優化實驗，方案見表1。氯化錳濃度設置2水平分別是150、350 μmol/L，半乳糖濃度設置2水平分別是10、50 mmol/L。

1.3.3 200 L培養規模糖型優化

在優化前工藝基礎上批次XDR200-1、XDR200-2、XDR200-3添加氯化錳和半乳糖調節劑的用量分別為222.22 mmol/L、35.56 mmol/L，而批次XDR200-4分別為150 mmol/L、35.56 mmol/L。

1.4 產量和質量檢測方法

IgG定量采用蛋白A親和高效液相色譜法檢測（Waters公司，Arc）；抗體純度采用分子排阻高效液相色譜（SEC-HPLC）方法進行檢測；電荷異構體采用離子交換高效液相色譜（CEX-HPLC）方法進行檢測，N-糖型采用2-AB標記法超高效液相色譜（Waters公司，H-Class）檢測[17] 。

1.5 統計分析方法

多因素DOE析因實驗結果使用JMP軟件進行分析，以G0、G0F、Man5和G1F這4種主要的糖型為響應建模，分析不同因子對其影響程度及趨勢[16] 。

2.1 不同糖型調節劑對糖型質量的影響

在搖瓶培養規模上進行Fed-batch細胞培養，進行氯化錳、半乳糖和尿苷這三種不同劑量糖型調節劑對糖型比例優化的效果，結果如表2、圖1、圖2所示。

氯化錳的高、中、低劑量分別是154、308和616μmol/L，在這個范圍內氯化錳對細胞生長、抗體產量、純度和電荷異構體比例均無明顯影響，但對糖型有明顯影響。氯化錳 616 μmol/L已將G0F降至低于地諾單抗，同時G0和Man5比例顯著升高，提示高濃度錳離子對單抗G0和Man5修飾影響較大；氯化錳 154 μmol/L和308μmol/L可將G0、G0F、Man5、G1F比例調節至與地諾單抗類似，提示氯化錳有效用量在154～308 μmol/L之間。

半乳糖的高、中、低劑量分別是15.4、30.8和61.6 mmol/L，在這個范圍內半乳糖對細胞生長、抗體產量、純度和電荷異構體比例均無明顯影響，其對糖型的G0、Man5無明顯影響，但可降低G0F比例及提升G1F比例，使其與地諾單抗類似，但其作用與劑量無明顯關系，提示半乳糖有效用量為30.8 mmol/L左右。

尿苷的高、中、低劑量分別是1.65、3.3和6.6 mmol/L，在此范圍內尿苷對細胞生長、抗體產量、純度和電荷異構體比例及糖型均無明顯影響，在后續的實驗中將不再使用尿苷來調節糖型。

2.2 多因素DOE析因糖型優化結果

以氯化錳、半乳糖為因子，以G0、G0F、Man5和G1F這4種主要糖型為響應，采用JMP軟件進行分析，結果表明，氯化錳對糖型影響顯著，隨濃度的升高顯著降低G0F、G1F比例，同時提高G0、Man5比例；半乳糖對糖型G0、G0F、Man5影響較小，對G1F影響顯著，隨著濃度升高可提高G1F比例（圖3）。根據意愿刻畫，確定氯化錳和半乳糖組合用量分別是222.22 mmol/L和35.56 mmol/L。

2.3 200 L培養規模放大試驗

搖瓶培養工藝條件下確定氯化錳和半乳糖用量后，將工藝放大至200 L規模，考察工藝的可放大性。進行連續3批工藝放大培養（XDR200-1、XDR200-2、XDR200-3），培養過程中細胞生長、活率、抗體產量一致性良好，批次間無顯著差異，經純化制備后抗體關鍵質量屬性純度、電荷異構體比例結果與工藝優化前無顯著差異，同時與地諾單抗保持一致（圖4、表3）；糖型G0、G0F、G1F比例較工藝優化前顯著改善（圖5），但與地諾單抗相比，G0F比例略低，Man5比例較高，可能原因為工藝放大后細胞生長環境的變化、不同反應器控制策略的差異導致細胞培養過程對糖型調節劑的需求量有所減少，結合小試單因素、DOE試驗中高濃度氯化錳對Man5比例調節的影響趨勢，推測Man5比例升高是因為工藝放大后細胞培養環境中錳離子濃度過高，因此降低氯化錳用量至150 mmol/L，進行第4批（XDR200-4）200 L培養試驗。結果表明，降低氯化錳濃度至150 mmol/L后，培養過程中細胞生長、活率及抗體產量均無影響，關鍵質量屬性純度、電荷異構體比例與工藝優化前產物及地諾單抗一致性良好；隨著錳離子量減少Man5比例較前三批結果顯著降低，與地諾單抗比例一致，G0F、G1F比例略有上升（表3、圖4、圖5）。綜合對比G0、G0F、Man5、G1F主要糖型比例，氯化錳、半乳糖用量分別為150 mmol/L和35.56 mmol/L時，主要糖型比例與地諾單抗高度一致，且抗體的其他質量屬性純度、電荷異構體比例無明顯差異，達到優化目的。

工藝過程中添加調節試劑是一種相對簡單有效的糖基化優化方式，但是不同調節試劑的濃度需求以及對不同糖基化類型的影響程度可能會有所差異，通常需要多種試劑的組合使用才能實現；同時，在工藝放大、培養規模變化時會引起細胞生長微環境的變化，從而導致對糖型調節試劑需求的變化，因此在小試工藝開發過程中需要兼顧工藝放大的可行性。本研究使用氯化錳、半乳糖通過單因素試驗、DOE分析對地諾單抗生物類似藥N-糖基化修飾比例進行優化，同時將優化工藝放大至200 L規模，實現地諾單抗生物類似藥糖基化水平與原研藥地諾單抗的高度可比。

利用DOE分析方法可有效通過較少的實驗次數，高效快速地確定糖型調節劑的交互影響及作用濃度，大大提高工藝優化效率。同時本研究在細胞培養過程中添加糖型調節試劑的工藝優化方式對地諾單抗生物類似藥的糖基化修飾調節是有效的，這為其他單克隆抗體生物類似藥工藝優化提供了較好的借鑒。

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