基于SSR標記的澳洲堅果種質資源遺傳多樣性分析

井敏敏　黃炳鈺　戴小紅　李棟梁　陳晶晶

摘? 要：澳洲堅果原產于澳大利亞亞熱帶雨林，是我國新興的重要經濟作物，其種質資源豐富，但遺傳背景復雜，親緣關系混亂。開展澳洲堅果種質資源遺傳多樣性分析，可拓展澳洲堅果種質資源創新利用途徑，有效加快澳洲堅果育種進程。形態表型分析是最早用于種質鑒定和管理的標記之一，但易受環境因素影響。DNA分子標記技術在種質資源鑒定、遺傳多樣性分析中克服了傳統表型分析易受環境影響的缺點。本研究采用9對高多態性SSR引物對91份國外引進以及自主選育品種（品系）澳洲堅果種質進行遺傳多樣性分析。結果表明，共擴增出73個等位基因位點，平均等位基因8個，平均基因多樣性為0.689，平均雜合度為0.578，多態性信息含量PIC為0.453～0.792，平均值為0.659，表明91份澳洲堅果具有較高的多態性。UPGMA聚類分析表明，在遺傳距離為0.33處，將91份澳洲堅果分為2大類，且其親緣關系與地理來源無顯著相關性，與主成分分析、Structure分析結果一致。本研究供試澳洲堅果材料群體內遺傳變異顯著高于群體間變異，且遺傳成分來源單一，遺傳結構較為簡單。本研究為澳洲堅果種質的有效利用以及核心種質構建提供理論基礎，為進一步加速澳洲堅果種質遺傳改良以及分子輔助育種奠定基礎。

關鍵詞：澳洲堅果;種質資源;SSR標記;遺傳多樣性

中圖分類號：S664.9??????文獻標識碼：A

Genetic Diversity Analysis of Germplasm Resources by SSR Markers

JING Minmin HUANG Bingyu DAI Xiaohong ?LI Dongliang CHEN Jingjing

South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / National Field Genebank for Tropical Fruits / Key Laboratory of Tropical Fruit Tree Biology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

， derived from the Australian subtropical rainforest， is a recently domesticated nut crop in China. is rich in germplasm resources. However， the genetic background of is complex and the genetic relationship is unclear. The genetic diversity analysis of germplasm resources can expand the innovative utilization of and effectively improve the breeding process. Morphological traits are among the earliest markers used in germplasm characterization and management. However， phenotypic analysis is easily affected by environmental factors， resulting in deviation in the results. DNA molecular marker technology overcomes the shortcomings of traditional phenotypic analysis vulnerable to environmental impact in germplasm resource identification and genetic diversity analysis. The genetic diversity of 91 germplasm introduced from abroad and self-breeding varieties （lines） was analyzed by 9 simple sequence repeat （SSR） loci in this study. The results showed that a total of 73 alleles were amplified by 9 pairs of SSR primers， with average of 8 per marker. The average genetic diversity was 0.689. The average heterozygosity was 0.578. The polymorphic information content （PIC） of each locus varied from 0.453 to 0.792 with an average of 0.659， indicating that germplasm had high genetic diversity. UPGMA cluster analysis showed that the tested resources could be divided into two groups at the genetic distance of 0.33. The first category includes all tetraphylla species， Nelmak1-1， Nelmak1-2 and HAMC14， with a total of 19 germplasms. The second category contains 72 germplasms， mainly the cultivated varieties in Australia and Hawaii and self-breeding varieties （lines） in China. There was no significant correlation between genetic relationship and geographical origin. The results were consistent with population genetic structure analysis and principal component analysis. For population genetic structure analysis， Bayesian clustering modelling was executed in the Structure software using data generated by SSR marker-based profiling and diversity analysis of 91 accessions. The highest log-likelihood was performed which provided the maximum peak at =2， indicating that all genotypes represent two distinct clusters. In addition， the results showed that the genetic components of germplasm were single and the genetic structure was relatively simple. AMOVA analysis showed that the genetic variation within populations was 90% and that among populations was 10%， indicating that the genetic variation of used in this research within population was significantly higher than that among population. This study provides a theoretical basis for the effective utilization of germplasm and the construction of core germplasm. In addition， we therefore aimed to use the SSR markers to accelerate genetic improvement in breeding program. These results lay a foundation for molecular marker-assisted breeding in .

; germplasm resources; SSR marker; genetic diversity

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.02.005

澳洲堅果（ F. Muell），別名夏威夷果、昆士蘭栗、澳洲核桃，屬山龍眼科澳洲堅果屬，常綠喬木，原產于澳大利亞昆士蘭州東南部和新南威爾州北部、南緯25°～31°的沿海亞熱帶雨林。澳洲堅果果仁含油率達60%～80%，含蛋白質、糖類約9%，并包含人體所必需的氨基酸以及豐富的鈣、磷、鐵和維生素，被譽為“堅果之王”，成為熱帶地區新興的經濟作物。澳洲堅果屬包含4個種，其中 Maiden & Betche、 L.A.S. Johnson及其雜交種廣泛用于商業種植。我國澳洲堅果種植起步較晚，近年來，我國云南、廣西、貴州等?。▍^）進行了大規模引種種植，2019年種植面積達24.5萬hm，全年總產量（未去殼果）0.494萬t，全年總產值152 278.6萬元（農業農村部農墾局統計）。澳洲堅果市場容量大，在我國具有很好的發展前景。

澳洲堅果種質資源豐富，但由于交叉引種、雜交、自然變異等因素，遺傳背景復雜，親緣關系混亂。因此，開展澳洲堅果種質資源的遺傳多樣性分析，可有效提升澳洲堅果育種進程。種質遺傳多樣性主要通過表型性狀和分子標記等方式進行評價。20世紀90年代起，國外研究學者借助表型性狀和同工酶開展了澳洲堅果遺傳多樣性分析。國內李文華對15個澳洲堅果品種幼齡期植物學形態進行觀察，陳業淵編制了澳洲堅果種質資源描述規范，王維對21份澳洲堅果種質資源的主要生物學特性進行了觀測研究，曾輝等主編出版了《澳洲堅果品種圖譜》，涵蓋‘H2’‘O.C’‘344’‘695’等主要栽培品種。

但是，表型性狀受外界環境影響較大，且要求種植者具有較高的技術經驗，其分析結果缺乏穩定性。近年來，分子標記技術發展迅速，AFLP、RAPD、RAF、ISSR、SSR、SNP等分子標記逐漸應用于澳洲堅果種質資源鑒定。

SSR又稱微衛星序列，1～6個堿基單元重復序列，為共顯性標記，具有多態性高、分布廣泛、遺傳穩定、操作簡便以及引物通用等優點，廣泛應用于作物遺傳多樣性分析、種質資源鑒定以及育種工作中。然而國內對澳洲堅果SSR分子標記的報道很少，僅報道了澳洲堅果SSR-PCR反應體系優化，以及雜交F1代SSR鑒定，未對種質資源進行系統性分析以及鑒定。本研究對國外引進以及自主選育品種（品系）的91份澳洲堅果材料，通過SSR分子標記技術進行遺傳多樣性分析，以期為澳洲堅果種質的有效利用以及核心種質構建提供理論基礎，進一步為加速澳洲堅果種質遺傳改良以及分子輔助育種奠定基礎。

?材料與方法

材料

參試澳洲堅果材料共91份（表1），新鮮幼嫩葉片材料均采集于中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所，采用75%酒精擦拭干凈，保存于–80℃備用。

提取與擴增

樣品DNA采用QIAGEN DNeasy Plant Kit（QIAGEN， Valencia， California， USA）提取，以0.8%瓊脂糖凝膠檢測DNA質量，并采用Nanodrop 1000分光光度計（Thermo Fisher Scientific， Wilmington， DE， USA）測定其濃度與純度，稀釋至20?ng/μL置于–20℃保存備用。本研究所用SSR引物參考NOCK等以及SCHMIDT等的文獻，篩選出9對穩定性好、多態性高的引物（表2），均由廣州艾基生物技術有限公司合成。PCR擴增體系為20?μL，含20?ng DNA模板、0.5?U DNA聚合酶、10?μL PCR?buffer、0.1?mmol/L dNTPs、2?mmol/L MgCl、0.2?μmol/L引物。擴增程序為：94℃預變性4?min，94℃變性30?s，退火30?s，72℃延伸40?s，28個循環;72℃延伸5?min;4℃保存。

PCR產物稀釋20倍，按照HT DNA Extended Range LABCHIP（PerkinElmer， USA）以及HT DNA 1k Reagent kit， Dual protocol（PerkinElmer， USA）使用說明，使用LabChip GX touch HT 24生物大分子儀（PerkinElmer， USA）對PCR產物進行毛細管電泳檢測，并在電腦上讀取條帶大小數據。

?數據處理

采用PowerMarker v3.25軟件計算每對SSR引物等位基因數（allele number）、最大等位基因頻率（major allele frequency）、基因多樣性（gene diversity）、雜合度（heterozygosity）、多態性信息量（polymorphism information content， PIC），并計算樣本間Nei’s遺傳距離，采用非加權分組算術平均法（UPGMA）進行聚類分析，使用MEGA5.2軟件進行聚類樹繪制。

使用GenALEx 6.4.1計算群體間分化系數（between-population differentiation， ）、群體內近交系數（inbreeding coefficients of individuals relative to the sub-population， ）和群體間近交系數（inbreeding coefficients of individuals relative to the total population， ），以及主成分分析、AMOVA分析。

采用Structure v2.3.4軟件對91份澳洲堅果種質進行遺傳結構分析，采用混合祖先模型（admixture model）和等位變異發生頻率相關模型（allele frequency correlated model），設置Length of Burn-in Period和Number of MCMC rers after buin in參數值分別為10?000和100?000，值設置為1～10，重復5次，將Structure運行結果打包上傳至Structure Harvester獲得最佳值，并采用CLUMPP軟件進行重復抽樣分析，最后采用Distruct1.1繪制遺傳結構圖。

?結果與分析

引物多態性分析

通過9對SSR引物對91份澳洲堅果種質進行PCR擴增，共檢測到73個等位基因位點（表3），各引物等位基因數量為5～11個，平均等位基因8個，最大基因頻率在0.313～0.703之間，平均基因多樣性為0.689，平均雜合度為0.578，多態信息

含量為0.453～0.792，平均值為0.659。其中Minμs04引物等位基因為11，基因多樣性為0.811，雜合度為0.824，多態信息含量PIC為0.792，各參數值相對較大，說明Minμs04具有較高的多態性，且雜合度較高，而多態性最小的MAC014基因多樣性為0.483，雜合度為0.374，PIC為0.453。表明9對引物具有較高的多態性，可用于進一步研究澳洲堅果遺傳多樣性。

?澳洲堅果種質聚類分析

將91份澳洲堅果種質由9對引物擴增的多態性條帶用PowerMarker 3.25軟件以UPGMA法進行聚類分析（圖1）。在遺傳距離為0.33處，可將91份澳洲堅果種質分為2大類，第一大類包含所有粗殼種以及Nelmak1-1、Nelmak1-2、HAMC14，共19份種質。其中粗殼種12與粗殼種14親緣關系很近，Nelmak1為南非選育的雜交品種，由于在實驗過程中發現種植園內有2種不同基因型的種質均命名為Nelmak1，所以本研究以Nelmak1- 1、Nelmak1-2標記來區分，且HAMC14、Nelmak1-1、Nelmak1-2聚為一類，說明三者親緣關系較近。第二大類包含72份種質，主要為澳大利亞、夏威夷主要栽培品種以及國內選育品種（品系），其中由中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所選育的南亞系列和實選系列可明確其親緣關系較近的栽培種，可由此推斷其可能父母本。從聚類圖中可發現澳洲堅果種質并不是嚴格按照地理來源進行分類，這說明其親緣關系與地理來源可能無顯著相關性。

?澳洲堅果種質主成分分析

澳洲堅果種質親緣關系可通過主成分分析直

觀表現，種質間位置遠近代表其遺傳相似性，位置越近，親緣性越近，位置越遠，遺傳差異越大。采用GenALEx軟件對91份澳洲堅果種質進行主成分分析，從圖2可以看出，來源于夏威夷、澳大利亞、中國的澳洲堅果種質之間存在交叉，說明部分種質親緣性較近。

?基于貝葉斯聚類法的遺傳結構分析

基于9對SSR引物獲得的多態性數據，使用Structure軟件中的貝葉斯聚類方法分析澳洲堅果群體遺傳結構。根據Delta 折線圖（圖3）所示，值為2時，Delta 最大，為278，即=2為最佳值，表明91份澳洲堅果種質的群體遺傳結構分析結果可分為2大類群（圖4中紅色代表類群1，綠色代表類群2）。類群1主要包含夏威夷的19份種質，中國44份種質，澳大利亞10份資源，以及南非1份資源。澳大利亞16份種質以及1份南非種質為類群2，并且此類群主要為粗殼種種質。根據各類群中主要顏色比率（值），將>0.6視為材料血緣比較單一，而<0.6表示材料具有混合來源，說明供試澳洲堅果種質遺傳成分來源單一，遺傳結構較為簡單。

? 群體遺傳分化

由表4 -統計結果顯示，澳洲堅果種質遺傳分化系數（）變幅范圍為0.035～0.299，平均值為0.168，群體內近交系數（）變幅范圍為–0.214～0.370，均值為0.075，群體間近交系數（）為–0.171～0.550，均值為0.220，基因流（）均值為1.941，說明91份澳洲堅果種質具有較高的遺傳分化，且存在一定的基因交流。AMOVA分析結果表明，供試澳洲堅果群體內遺傳變異為90%，群體間遺傳變異為10%，表明澳洲堅果群體內遺傳變異顯著高于群體間變異。

?討論

遺傳多樣性的研究對于種質資源的遺傳改良、雜交育種以及創新利用具有重要意義，SSR標記在澳洲堅果上的應用，有助于了解澳洲堅果種質的遺傳多樣性以及親緣關系，對澳洲堅果種質資源進一步挖掘與育種工作具有參考價值。NOCK等基于二代測序技術開發了12對澳洲堅果SSR分子標記引物，在22個品種中，12對引物均具有多態性，平均觀察雜合度和期望雜合度分別為0.571和0.626，共檢測到71個等位基因，并且能很好地區分4種澳洲堅果種質、、以及。LANGDON等采用11對SSR引物對‘741’以及其他8個品種開放授粉后代進行父母本鑒定，指出不同品種澳洲堅果自交能力存在顯著差異，并且澳大利亞種植最廣泛的2個品種‘741’與‘344’之間存在一定親緣關系。本研究采用9對SSR引物對91份澳洲堅果種質進行擴增，共檢測出73個等位基因位點，基因多樣性均值為0.689，PIC變化范圍為0.453～0.792，平均0.659，說明9對引物可較好地鑒別澳洲堅果種質的遺傳差異性。

本研究中91份澳洲堅果材料的UPGMA聚類、PCA主成分分析、以及Structure遺傳結構分析的結果基本一致，且相互補充，采用的9對SSR引物將91份澳洲堅果種質分為2個類群，聚類結果表明，不同來源地種質聚集交錯，與地理分布沒有顯著相關性，與譚秋錦等基于SNP分子標記的澳洲堅果種質遺傳多樣性分析中具有相同結論。同時Structure結果表明，供試澳洲堅果種質遺傳成分來源單一，遺傳結構較為簡單，在其他研究中具有相同報道。HARDNER等報道全球澳洲堅果生產主要基于100年前夏威夷育種項目中優良種質的嫁接繁育，并且可能僅有一到三代來源于野生資源。NOCK等采用葉綠體基因組測序開發了SNP，對37份野生資源以及26份主栽品種進行親緣關系分析，發現野生資源具有高水平的變異，但大部分夏威夷品種來源于位于昆士蘭東南部Moolo和Mt Bauple的2個野生地點，來源非常狹窄。

指數反映群體等位基因雜合性水平，用來衡量種群分化程度。本研究91份澳洲堅果種質變化范圍為0.035～0.299，平均值為0.168，表明澳洲堅果具有較高的遺傳分化。O’CONNOR等采用SNP對29個母本及295個子代進行群體結構、遺傳多樣性分析，在子代中檢測到高水平差異（=0.518）以及較大遺傳分化（= 0.401）。AMOVA分析結果表明澳洲堅果群體間與群體內均存在遺傳變異，但群體內遺傳變異顯著高于群體間變異。

我國澳洲堅果從20世紀80年代后期開始商業性種植，經過30多年發展，種植面積已居世界第一。目前我國已收集保存了較豐富的澳洲堅果種質資源，前期研究報道我國澳洲堅果種質資源遺傳基礎較窄，大致分為夏威夷類群和澳大利亞類群，本研究中供試的我國澳洲堅果種質與夏威夷、澳大利亞主要栽培品種聚為一大類，除此之外，我國澳洲堅果品種多由開放授粉的實生后代選育，雜交育種進展緩慢，對各種優質、高抗等優良性狀種質資源挖掘與利用、新種質創制研究較弱。這說明今后在澳洲堅果選育中，應該加大引進優異野生資源力度，增加種質的遺傳多樣性，拓寬遺傳基礎。

本研究采用9對SSR引物對91份澳洲堅果種質進行了遺傳多樣性分析，初步明確了供試澳洲堅果種質的群體結構，為澳洲堅果種質資源鑒定和創新利用提供數據支撐，并且對澳洲堅果雜交育種以及優良種質創制具有重要的指導意義。

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18. 收稿日期 2021-05-10;修回日期 2021-07-06

    基金項目 中國熱帶農業科學院基本科研業務費專項（No. 1630062020001）;農業農村部物種品種資源保護費項目（No. 12516

    3006000160001）;國家熱帶果樹種質資源圃平臺運行服務項目（No. 125163006000150007）。

    作者簡介 井敏敏（1990—），女，碩士，研究實習員，研究方向：熱帶果樹種質資源。*通信作者（Corresponding author）：

    陳晶晶（CHEN Jingjing），E-mail：chenjingjing0704@163.com。