3種氟喹諾酮聯合暴露對銅銹環棱螺的急性致死效應

張小旭，馬陶武，李金曼，羅奔向，周影茹，何興兵，王萌

吉首大學生物資源與環境科學學院，吉首 416000

氟喹諾酮類抗生素(fluoroquinolones, FQs)是在以4-喹諾酮為基本骨架的基礎上引入氟原子，人工合成的一類抗生素[1]。FQs通過抑制DNA的促旋酶和拓撲異構酶Ⅳ，阻礙DNA的正常轉錄和復制從而產生殺菌作用[2]。常用的FQs包括環丙沙星(ciprofloxacin, CIP)、諾氟沙星(norfloxacin, NOR)和左氧氟沙星(levofloxacin, LEVO)(表1)。由于FQs具有抗菌范圍廣、抗菌活性強和價格低等優點[3]，因此被廣泛使用于人畜疾病的預防與治療，其使用量近年來在世界范圍內持續增長[4]。伴隨FQs的大量使用，其不可避免地進入環境當中。水環境是FQs的主要環境歸宿[5]，近年來，FQs在全球范圍內的水體中被頻繁檢出。其中河流和湖泊中的平均檢出濃度達到ng·L-1。如孫秋根等[6]對我國太湖流域中宜溧-洮滆水系中FQs的研究發現其中氧氟沙星(ofloxacin, OFL)的檢出率達到60.5%，FQs總檢出濃度達到127～1 210 ng·L-1；Valdés等[7]在阿根廷的某河流中67%的樣本中檢測到FQs，其中OFL和CIP在上覆水中的最高檢出濃度分別為69 ng·L-1和78 ng·L-1；付雨等[8]在我國白洋淀水體中檢測出FQs的濃度達到0.738～2 004 ng·L-1；Wagil等[9]對波蘭河流中FQs檢測發現，其檢出濃度達到2.7 μg·L-1。

表1 3種氟喹諾酮類抗生素(FQs)的分子結構Table 1 Molecular structure of 3 fluoroquinolones (FQs)

已有大量研究表明，進入水環境中的FQs會對水生生物產生毒性作用，如導致水中微生物活性喪失和降低生物群落的多樣性[10]。FQs還會積累在魚類的組織中，影響魚的發育，損害其心血管和代謝系統，并改變魚的抗氧化和免疫反應[11]。目前，關于FQs對水生生物的急性毒性效應已引起了廣泛關注，研究結果表明水生生物暴露于高濃度的FQs中會對其產生急性致死效應[12-13]。然而當前關于FQs生態毒理的研究大多是基于單獨的某種FQs，而關于不同FQs聯合作用的研究較少。在受FQs污染的水環境中，往往存在多種FQs[14]。如Du等[15]對鹽城沿海地區25種抗生素的分布調查中發現一份樣品中至少檢出3種以上的FQs，且通過對FQs的風險評估發現單一FQs對水生生物的風險較低，而混合FQs產生的潛在風險可能高于預期風險；Liu等[16]調查膠州灣的濕地表層中FQs，發現所有樣品中都檢測到了FQs，共有8種FQs，其中NOR對環境可能達到中風險水平。鑒于此，為了合理評估FQs的潛在生態風險，需要針對不同種類FQs的聯合生態毒理開展研究。

我國生態環境部在2020年12月發布的《化學物質環境與健康危害評估技術導則(試行)》[17]中明確指出，在進行生態毒理學數據的篩選和評估時應優先采用我國本土生物的實驗數據。銅銹環棱螺(Bellamyaaeruginosa)屬于腹足綱田螺科的淡水軟體動物，是我國淡水環境中一種主要底棲大型無脊椎動物。近年來，已有大量使用銅銹環棱螺對污染物生態毒性進行評價的相關研究見諸報道[18-20]，本研究使用銅銹環棱螺幼螺為受試生物，以CIP、LEVO和NOR為目標污染物，考察了3種FQs單一及聯合暴露的急性毒性效應，分析了聯合作用模式。本研究結果可為合理評價FQs的潛在生態風險提供理論依據，并為發展銅銹環棱螺在生態毒理學中的應用提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 測試生物

本次實驗所用的銅銹環棱螺種螺采自吉首市峒河濕地公園潔凈水體，在實驗室人工控制條件下按照Ma[21]的方法進行培養：采用上覆水(水溫(24±1) ℃，pH 7.99±0.15，硬度(78.4±3.3) mg·L-1)循環系統進行培養并連續繁殖，每日投喂一次商用魚飼料(三元牌，中國)，光周期為16 h∶8 h(光∶暗)。每日將新生幼螺挑出并單獨培養。本研究選擇同批次出生的大小均勻的健康幼螺(7日齡，(0.04±0.002) g)用于暴露實驗。

1.2 個體毒性測試暴露方法

1.2.1 單一毒性測試

根據預實驗結果將CIP和LEVO(98%，聯碩生物科技有限公司，中國)暴露濃度設置為25、50、100、200和400 mg·L-1，NOR(98%，聯碩生物科技有限公司，中國)暴露濃度設置為12.5、25、50、100和200 mg·L-1，并設空白對照組(0 mg·L-1)。每組設3個平行，所有溶液配制均使用超純水。暴露實驗于90 mm培養皿中進行，每個培養皿放入10只幼螺及46 mL對應濃度的溶液。在生化培養箱(SPL-250，天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司，中國)中于25 ℃下暴露96 h，每24 h更換暴露液，每8 h觀察并記錄死亡螺數量，以將幼螺取出放入清水中靜置觀察10 min，期間幼螺無主動反應為死亡依據，螺死亡后及時取出。為確保數據有效性，共進行3次重復實驗

1.2.2 二元、三元聯合毒性測試

培養皿中加入二元復合工作液(CIP+NOR、CIP+LEVO、NOR+LEVO)及三元復合工作液(CIP+NOR+LEVO)，其濃度均為相應FQs單獨暴露下的10%致死濃度(LC10)、20%致死濃度(LC20)和半致死濃度(LC50)的等毒效應比混合，每組設3個平行。

1.3 聯合毒性評價方法

采用毒性單位法(TU)、混合毒性指數法(MTI)對CIP、NOR和LEVO二元、三元聯合毒性作用模式進行分析。

毒性單位法和混合毒性指數法對聯合毒性作用模式的計算方法如公式(1)～(4)所示[22]。

TUi=Am/Ai

(1)

(2)

S0=S/(TUi)max

(3)

MTI=1-lgS/lgn

(4)

式中：TUi為混合物中i組分的毒性單位；Am為聯合染毒后混合物中i組分相應的LC值(mg·L-1)；Ai為i組分單獨染毒后相應的LC值；S為各組分生物毒性單位相加之和；(TUi)max為混合物中所有組分的毒性單位的最大值；S0為生物毒性單位之和與毒性單位最大值的比值；MTI為混合毒性指數；n為混合物中各組分的種類個數。

聯合毒性作用分為獨立、相加、協同和拮抗4種作用類型，判斷依據如表2所示[23]。

表2 聯合毒性作用類型判斷方法Table 2 Combined toxicity type judgment method

1.4 數據處理

使用SPSS 21.0軟件，采用Probit回歸模型分析計算LC10、LC20和LC50值；使用OriginLab 2021繪制隨著時間和濃度增加死亡數變化的柱狀圖。

2 結果(Results)

2.1 單一暴露致死效應

圖1顯示了3種FQs在不同暴露時間段和濃度下銅銹環棱螺的死亡數量?？傮w而言，死亡數量與FQs暴露時間和濃度呈正比。如圖1(a)所示，在25 mg·L-1和200 mg·L-1CIP下暴露24 h不會導致幼螺發生死亡，死亡主要發生在暴露48 h，隨著暴露時間的增加，死亡數隨暴露濃度的增加而顯著增加，最高暴露濃度下的幼螺死亡率最高；如圖1(b)所示，在最低和最高濃度NOR下暴露24 h不造成幼螺死亡，死亡主要出現在72 h，隨著暴露時間的增加死亡數增加；如圖1(c)所示，LEVO暴露下死亡主要出現在24 h，其中100 mg·L-1處理組的死亡數在72 h時顯著上升，96 h死亡數有所降低但仍高于24 h和48 h，在高濃度處理組(200 mg·L-1和400 mg·L-1)中，隨著暴露時間的增加，死亡數有所增長。3種FQs對螺的急性致死效應按大小排列依次為NOR>CIP>LEVO。根據死亡數計算出96 h LC10、LC20和LC50如表3所示。

圖1 FQs暴露不同時間下銅銹環棱螺死亡數量注：(a) CIP；(b) NOR；(c) LEVO。Fig. 1 Number of dead Bellamya aeruginosa under FQs exposure at different timeNote:(a) CIP; (b) NOR; (c) LEVO.

表3 3種FQs暴露96 h對銅銹環棱螺幼螺的致死效應Table 3 Lethal effects of 3 kinds of FQs on Bellamya aeruginosa larva after exposure for 96 h (mg·L-1)

2.2 聯合暴露致死效應

二元體系(CIP+LEVO、CIP+NOR和NOR+LEVO)及三元體系(CIP+LEVO+NOR)對銅銹環棱螺幼螺的聯合毒性評價分別如表4～7所示。由表4可知，CIP和LEVO聯合暴露下，對螺的毒性作用在24 h均表現為拮抗作用；48 h LC10、LC20表現為協同作用，48 h LC50表現為拮抗作用；96 h LC10、LC20表現為協同作用，96 h LC50表現為部分相加作用。CIP和NOR(表5)以及NOR和LEVO(表6)聯合暴露下表現出相同的作用，即對螺的毒性作用在24 h和48 h時均表現為拮抗作用，然而，在暴露至96 h時，轉變為協同作用。CIP、NOR和LEVO聯合暴露24 h對螺的毒性作用均為拮抗作用；48 h LC10表現為協同作用，48 h LC20表現為部分相加作用，48 h LC50表現為拮抗作用，96 h均表現為協同作用(表7)。

表4 CIP和LEVO聯合暴露對銅銹環棱螺幼螺的毒性作用Table 4 Toxic effects of CIP and LEVO combined exposure on Bellamya aeruginosa larva

表5 CIP和NOR聯合暴露對銅銹環棱螺幼螺的毒性作用Table 5 Toxic effects of CIP and NOR combined exposure on Bellamya aeruginosa larva

表6 NOR和LEVO聯合暴露對銅銹環棱螺幼螺的毒性作用Table 6 Toxic effects of NOR and LEVO combined exposure on Bellamya aeruginosa larva

表7 CIP、NOR和LEVO聯合暴露對銅銹環棱螺幼螺的毒性作用Table 7 Toxic effects of CIP, NOR and LEVO combined exposure on Bellamya aeruginosa larva

3 討論(Discussion)

本次研究中的3種FQs單一暴露下幼螺死亡數均隨著時間和濃度的增加呈上升趨勢。與本研究結果類似，Peltzer等[24]的研究表明，隨著暴露于低濃度FQs的時間和濃度的增加，蟾蜍幼蟲(Rhinellaarenarum)生長和發育受到的影響會逐漸增加。Shen等[25]研究了多種FQs單一暴露24 h后斑馬魚的致死率，發現斑馬魚的致死率隨著FQs濃度的增加而升高，與本次實驗中銅銹環棱螺幼螺死亡率隨濃度的增加而升高一致。通過比較本研究中3種FQs間的LC50可知NOR的毒性大于CIP和LEVO。He等[18]用NOR和OFL對銅銹環棱螺幼螺進行急性毒性實驗，研究發現NOR的毒性大于OFL。根據《新化學物質危害評估導則》(HJ/T 154—2004)[26]，化學品生態毒理學危害性按LC50可分為極高(≤1 mg·L-1)、高(>1～10 mg·L-1)、中(>10～100 mg·L-1)和低(>100 mg·L-1)。據此，CIP和LEVO對銅銹環棱螺幼螺屬低度生態毒理學危害，而NOR屬于中度危害。

目前關于不同FQs間聯合毒性作用的研究已有一些報道，如Riaz等[27]研究了CIP、LEVO和恩諾沙星(enrofloxacin, ENR)聯合暴露對小麥萌發和溫室沙土培養下的短期毒性，結果表明FQs在低濃度下便會發生協同毒性作用；Wang等[14]探究了紅霉素和ENR單一及聯合暴露對小球藻的毒性，發現聯合暴露對小球藻的抗氧化和光合系統有更大的刺激作用。上述研究結果與本文中暴露96 h后各濃度產生的毒性作用趨向于協同作用的結果一致，指示不同種類FQs的聯合污染產生的風險不容忽視。此外，本研究結果還顯示，在暴露至24 h時聯合毒性作用均為拮抗，而在96 h時絕大部分均轉為協同作用，僅有CIP+LEVO在LC50濃度下為部分相加作用。Magdaleno等[28]用6種抗生素分別二元聯合對羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)進行了復合暴露，結果表明聯合暴露產生的毒性作用在前期為拮抗作用，后期為協同作用，這與本研究結果一致。對于聯合暴露毒性在前期表現為拮抗作用的原因可能是不同化合物間在生物體內發生了競爭吸收作用[29]。Xu等[30]的研究指出CIP可通過下調藥物代謝酶CYP3A29的基因表達和阻礙CYP3A29與ENR的結合而延緩ENR在豬肝臟中的代謝，這可能是本研究中不同FQs間聯合暴露毒性最終趨向協同作用的潛在機制。

目前針對FQs對水生生物毒性的研究大多使用國際上通用的模式生物，如Han等[31]研究了17種FQs對斑馬魚胚胎的致死效應，研究結果表明CIP和LEVO的LC50分別為619.618 mg·L-1和5 420.595 mg·L-1；Xi等[12]的研究表明1 200 mg·L-1的NOR對斑馬魚胚胎暴露96 h后，死亡率為46.7%。相比于本次實驗所使用的銅銹環棱螺幼螺，上述研究中FQs對斑馬魚胚胎的LC50較高，指示銅銹環棱螺幼螺對FQs暴露的敏感性更高。Kergaravat等[32]使用大型溞(Daphniamagna)和網紋溞(Ceriodaphniadubia)研究了莫西沙星(MOXI)的生態毒性，結果顯示大型溞暴露48 h和72 h的LC50分別為14.2 mg·L-1和3.4 mg·L-1，網紋溞暴露48 h和72 h的LC50分別為29.2 mg·L-1和5.4 mg·L-1，表明水溞類對FQs暴露較為敏感。大量研究證實FQs在進入水環境后傾向于富集于沉積物當中，其在沉積物中濃度遠高于地表水[33]，因此開展基于沉積物介質的FQs生態毒理研究具有重要科學意義。為順利開展該方面的研究迫切需要一種營沉積物棲居且對FQs較為敏感的受試生物，本研究結果表明本土淡水底棲大型無脊椎動物銅銹環棱螺對FQs暴露較為敏感，是一種適合開展FQs在我國水環境尤其是沉積物中生態風險評價的受試生物。

當前關于FQs對水生生物的毒性效應已受到大量關注，然而對于不同FQs的聯合毒性效應研究較少。本研究考察了3種FQs單一及聯合暴露對本土生物銅銹環棱螺幼螺的致死效應。單一暴露結果表明NOR對銅銹環棱螺幼螺為中度危害，而CIP和LEVO為低度危害。銅銹環棱螺對FQs暴露較為敏感，是一種適合開展FQs在我國水環境中生態風險評價的受試生物。聯合暴露研究結果顯示3種FQs的毒性作用趨向于協同作用，指示盡管FQs單獨暴露導致的毒性效應較低，然而鑒于不同FQs往往共存于水環境當中，其聯合毒性作用可能會導致更高的水生態風險，需對其開展深入研究。