低氧環境下VEGF及其受體的造血調控作用及機制研究進展*

李治材 肖軍 李翠瑩

低氧是一個常見的不利環境因素，機體通過調節各種應激因子以抵抗這種環境所帶來的影響。低氧誘導因子（hypoxia inducible factors，HIFs）是最主要感受低氧的轉錄因子，主要包括HIF-1α和HIF-2α，通過調控其下游靶基因EPO（促紅細胞生成素）、VEGF、血管內皮生長因子受體1（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR-1，又稱fms樣酪氨酸激酶1，Flt-1）、血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor2，VEGFR-2，又稱胎肝激酶1，Flk-1，又稱KDR）的表達，增加紅細胞生成和血管生成以改善組織缺氧。然而，長期處于低氧環境，會引起紅細胞的過度增生，導致血液黏度增加，血液動力學改變，反而加重低氧。一般認為，EPO是調控低氧環境下紅細胞生成的重要因素，其對低氧下紅細胞過度積累發揮著至關重要的作用。然而，近年來，越來越多的研究發現EPO與紅細胞生成并不完全相關，EPO也無法解釋所有的紅細胞生成增加[1]；VEGF是一種與血管生成和造血密切相關的生長因子，涉及Ras/MAPK、PI3K-AKT、Stat3等與細胞增殖分化相關的多條信號通路，VEGF及其受體VEGFR-1、VEGFR-2的過度表達常常與異常造血有關[2]。因此，本文對低氧條件下VEGF在造血中的作用進行梳理和闡述，以期望對低氧和造血相關疾病提供更豐富的認識和更多的治療思路。

1VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的結構功能及表達

1.1VEGF及其受體VEGFR-1、VEGFR-2的結構與功能：VEGF是一類分泌性糖蛋白，包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE和胎盤生長因子（plasma placental growth factor，PLGF）等成員。其中，關于VEGFA的研究是最廣泛的，VEGFA是一個分子質量在34-42KD，由反平行多肽構成的同源二聚體，中間由兩個二硫鍵連接。VEGFA根據不同的剪切形式又可形成不同的亞類，如VEGFA121、VEGFA165、VEGFA189、VEGFA206等，其中VEGFA165是人體內含量最多分布最廣泛的亞類[3]。研究表明，VEGF主要是通過與其受體結合后進行相應信號轉導而發揮促進造血的作用。與VEGFA結合的主要是VEGFR-1和VEGFR-2，它們同屬于典型的Ⅲ型酪氨酸激酶受體，由一個（Ig）同源結構域組成的胞外區、一個跨膜結構和一個裂解酪氨酸激酶結構域；VEGFA與其受體Ig樣結構域結合，使受體的酪氨酸激酶結構域構象發生改變，受體被激活，底物蛋白發生磷酸化，激活下游的Ras/MAPK、Stat3、PI3K/AKT等信號轉導途徑，影響細胞增殖、分化，在一些血液系統惡性增殖性疾病中，如淋巴瘤、白血病等，異常腫瘤細胞VEGF、VEGFR-2表達升高。此外，VEGFR-1、VEGFR-2在體內還存在可溶型（sVEGFR）形式，通過拮抗VEGF，降低VEGF水平，抵抗血管生成和造血[4]。

1.2VEGF及其受體VEGFR-1、VEGFR-2與低氧的關系：VEGF是公認的血管生成因子，其產生主要受HIFs的調節。HIFs是一種調節細胞低氧反應的核心氧感受因子，由功能亞基（HIF-1α、HIF-2α）和調節亞基（HIF-β）共同參與低氧應答。常氧條件下，HIF-α被脯氨酰羥化酶（PHD）羥基化，然后與腫瘤抑制因子（VHL）結合，最終被泛素化降解；低氧條件下，PHD活性受到抑制，HIF-α進入細胞核與HIF-β形成二聚體，結合低氧反應元件（HRE）調節靶基因的表達，HIF-1α與HIF-2α有著部分共同的靶基因，但其在低氧下對這些靶基因的調控卻又相互獨立。目前認為，VEGF主要受HIF-1α調控，而VEGFR-1、VEGFR-2則主要受HIF-2α調控[5-6]。HIF-1α在低氧早期以及嚴重缺氧時活性最高，通過與靶基因VEGF、EPO轉錄相關區域結合啟動最初的低氧反應。而在慢性缺氧條件下是由HIF-2α調節下游基因EPO、VEGFR-1、VEGFR-2的表達[7]。

2血管內皮生長因子及其受體與造血

2.1骨髓內皮細胞在造血中的作用：骨髓內皮細胞是骨髓造血微環境的重要組成部分，骨髓內皮細胞和血管周圍細胞共同構成血管周生態位，通過表達白細胞介素-6（interleukin6，IL-6）、干細胞因子（stem cell factor，SCF）等因子調控造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）、造血祖細胞（hematopoietic progenitor cells，HPC）的自我更新和分化[8]。研究證明造血重建與內皮細胞的再生有關，骨髓內皮細胞可以產生多種細胞因子并支持人體外CD34陽性細胞的增殖和分化，注射自體或者異源的內皮細胞可以促進放射清髓后的造血干細胞恢復和重建[9]。在體內，骨髓內皮細胞表達HSC維持和再生所需的生長因子，包括SCF、趨化因子CXCL12和多效生長因子（pleiotrophin）[10]，從內皮細胞中條件性敲除這些因子會使骨髓中的HSC明顯減少，在慢性骨髓增生性腫瘤中發現攜帶JAK2V617F基因突變的內皮細胞與異常造血相關，并能增加患者骨髓HSPC對輻射的耐受性[11]。VEGFR-2存在于血管內皮細胞，對內皮細胞功能的發揮非常重要，VEGFR-2陽性的血竇內皮細胞被認為是放療后造血干細胞恢復所必需的，HOOPER等發現骨髓血竇內皮細胞表達VEGFR-2，內皮VEGFR-2缺失的小鼠在接受全身輻照后骨髓血管再生和造血恢復受到明顯抑制，注射VEGFR-2抗體也可以抑制造血干細胞的恢復[12]。此外，骨髓的內皮功能也會受到其他因素的影響，進而影響造血；心血管方面的疾病如高血壓、動脈粥樣硬化、心肌梗死等會引起骨髓內皮功能障礙、滲漏，重塑血管骨髓生態位，刺激造血和炎性白細胞的產生[13-14]，HEYDE等也同樣發現動脈粥樣硬化患者HSC、髓系共同祖細胞增殖率明顯升高[15]。以上研究表明，骨髓內皮細胞對造血的維持是必不可少的，內皮細胞影響骨髓造血。

2.2血管內皮生長因子及其受體在胚胎造血中的作用：胚胎造血發生在氧濃度為1%～5%的子宮內，子代通過胎盤屏障獲得的氧氣較少，子宮中的生理性低氧環境對胚胎期造血的發育起到決定性作用。低氧環境下，HIF控制著對下游靶基因VEGF、VEGFR-2、TGF-β的表達，敲除HIF-1α基因的小鼠，在胚胎發育E9.5～E12.5會出現心血管、造血系統發育不全而死亡[16]。VEGF及其受體對胚胎造血發育也發揮著重要作用，敲除小鼠VEGF或受體VEGFR-2都會導致胚胎致死，同時伴隨著造血發育的異常，VEGF缺乏一個等位基因的小鼠在11 d～12 d之間的胚胎發育過程中缺乏足夠的內皮細胞和造血細胞而死亡；純合VEGFR-2的缺失小鼠在胚胎8.5 d～9.5 d之間死亡，伴隨著中胚層造血細胞分化的阻滯，不能遷移形成血島[17]。最近的研究發現，中胚層前體階段內皮和造血發育需要VEGF，外源性VEGF有利于造血和內皮標志物的表達[18]。另外，VEGF在胚胎干細胞紅系分化方面也有一些發現，CERDAN等誘導胚胎干細胞（human embryonic stem cells，hESCs）分化的研究顯示，VEGF的添加特異性增加了紅系集落形成單位（erythroid colony forming units，CFU-E）的數量，并促進了SCL/TAL-1基因的表達，在誘導7 d時，表達血型糖蛋白A（CD235a）和CD34的細胞數量高出對照3倍[19]。LIANG等在斑馬魚胚胎發育中觀察到，注射VEGF mRNA的斑馬魚胚胎中，VEGFR-2、SCL、GATA1轉錄物的產生明顯增加，血紅蛋白染色明顯增強[20]。上述研究表明，低氧是胚胎造血發育的重要環境因素，低氧下VEGF促進胚胎干細胞來源的早期紅細胞表面標志物的表達以及紅系祖細胞的自我更新。

2.3血管內皮生長因子及其受體在成體造血中的作用：骨髓是成體造血的主要器官，由骨髓造血細胞和骨髓微環境構成。骨髓微環境最大的特點就是低氧，其氧濃度僅為1%～6%，低氧環境下細胞HIFs水平增加，有利于骨髓細胞表達VEGF和VEGFR-2，骨髓微環境中VEGF濃度明顯高于外周血[21]。VEGF與造血細胞表面的VEGFR結合，直接參與造血調控[22]。在骨髓造血細胞中，CD34陽性造血干/祖細胞表面均表達VEGFR-1和VEGFR-2，而向各系分化后，VEGFR-2表達迅速減少，而VEGFR-1廣泛表達于紅系前體細胞、單核-巨噬細胞以及巨核細胞表面[23]。目前認為，VEGF內分泌途徑對調節HSC存活也有重要作用，VEGF基因敲除后小鼠HSCs的存活率、集落形成能力和增殖率降低，并且使用可溶性VEGFR-1（sVEGFR-1）拮抗VEGF后對HSCs存活率僅有較小的影響，表明內分泌途徑能夠促進HSCs的存活[24]。在慢性高原病中研究發現，慢性高原病患者骨髓細胞HIF-2α顯著升高，骨髓組織和血漿中VEGF的濃度也顯著升高，且VEGF與氧飽和度（SaO2）呈負相關，與血紅蛋白（Hb）濃度呈正相關[25-26]。SU等研究證實，HIF-2α與骨髓組織VEGF、骨髓單個核細胞（BMMNCs）VEGFR-2的表達呈正相關，VEGFR-2的表達有利于紅細胞生成和骨髓微血管形成[21]。

關于VEGF受體的研究表明，VEGFR-1主要與造血干細胞動員、遷移有關，并參與造血重建，藥物阻斷VEGFR-1表達后，骨髓表現為造血干細胞增殖、分化受抑制，骨髓造血重建失敗[27]。小鼠體內實驗證實，VEGF缺陷的造血干細胞移植無法重建受到輻射破壞的造血系統，而在體內刺激VEGFR-1完全逆轉了這種現象[28-29]。因此，VEGFR-1因此也被證實可參與調節造血干細胞的細胞周期和分化，是促進造血干細胞動員的重要分子。VEGFR-2是VEGF發揮功能的主要受體，在促進造血干/祖細胞增殖、抑制細胞凋亡中起著重要作用。研究發現，成年鼠VEGF缺乏導致HSC數量的大量減少，用VEGF突變體特異性激活VEGFR-2能夠提高HSC的存活率，促進其自我更新[30]；近年來有觀點認為，VEGFR-2可能是HSC的一個關鍵性標志，不僅是因為造血細胞起源于造血內皮，更重要的是它具有長期增殖和多向分化的能力[31-32]。已有研究發現表明成體中的內皮祖細胞亦可來源于CD34+VEGFR-2+的細胞群，體外誘導實驗表明，CD34+VEGFR-2+細胞群不但能在單細胞水平上產生造血克隆和內皮細胞克隆，而且該細胞群具有長期擴增能力，顯示出原始干細胞的典型特征[33]。ZIEGLER等人研究發現，CD34+VEGFR-2+的骨髓細胞是造血干細胞的重要來源，CD34+VEGFR-2陰性的細胞群往往只具有短期造血的功能，VEGFR-2是HSC長期再增殖的關鍵標志物，因而提出將VEGFR-2作為造血干細胞的重要鑒定指標之一[34]。在造血分化方面，VEGF-A超等位基因雜合小鼠骨髓培養物中觀察到CFU-E數量顯著升高，并且這種升高能夠被VEGFR-2的中和抗體阻斷，且VEGF僅對CFU-E的數量和大小有直接的促進作用[35]；在巨核細胞中的研究也證實，VEGFR-2抑制劑可導致巨核細胞標志物表達的顯著減少，減少了巨核細胞的分化[30]。以上研究表明，低氧是造血細胞表達VEGF和VEGFR的必要環境，VEGFR對造血干、祖細胞存活、增殖以及造血細胞分化方面產生重要的影響。

2.4血管內皮生長因子及其受體對惡性腫瘤性疾病造血功能的影響：低氧是腫瘤微環境十分常見的現象，低氧環境有利于白細胞介素6、轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）、血管內皮生長因子等細胞因子分泌，在非小細胞肺癌患者癌組織中HIF-2α、VEGF均明顯高于癌旁組織，并且HIF-2α與VEGF之間呈明顯的正相關[36]。另有研究發現，VEGF在乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中均有高表達，腫瘤衍生的VEGF進入循環并作用于內皮細胞和造血細胞以調節血管生成和造血，循環VEGF促進骨髓中VEGFR-1陽性的HSC動員到外周血，并進入脾臟造血，導致腫瘤患者常常伴隨著脾大[37]；同時，由于骨髓HSC的數量減少，骨髓造血功能減弱，機體處于貧血狀態，而使用抗VEGF藥物可顯著改善患者的骨髓造血和貧血狀況。小鼠中的研究有著同樣的結果，在給小鼠植入能產生VEGF的腫瘤細胞14 d后，小鼠骨髓造血細胞減少，外周血VEGF升高并伴隨著嚴重貧血，外周血分析顯示血細胞比容顯著降低，外周血血紅蛋白和紅細胞數量顯著降低，髓外造血旺盛，肝脾腫大，含有高密度的成紅細胞和網織紅細胞[38]。此外，VEGF及其受體的過表達常見于血液系統惡性腫瘤[39]，VEGFR-2在紅白血病細胞中表達升高，同時脾臟基質細胞分泌的VEGF顯著增加，體外實驗表明，VEGF增加了小鼠紅白血病細胞的增殖率[35]，用針對VEGF的中和抗體治療的紅白血病小鼠生存期更長[40]，在人紅白血病細胞（TF1）中的研究證實，外源性VEGF刺激VEGFR-2能夠誘導細胞增 殖和存活[30]。近期的臨床研究發現VEGF及其受體與淋巴瘤的發展存在相關性，淋巴瘤診斷初期血清VEGF較低，經治療后，血清VEGF顯著升高[41]。上述研究表明，VEGF及其受體在惡性腫瘤性疾病的發生、發展中發揮重要的作用，同時可能對造血系統產生影響。

3結語與展望 通過以上研究可以看出，低氧環境對VEGF及其受體的表達至關重要，而后者參與對造血發育的調控，通過誘導與造血相關轉錄因子調節胚胎早期造血；通過細胞表面受體VEGFR-1和VEGFR-2參與HSC的動員、造血重建，調控造血細胞的增殖、分化，而VEGF及其受體的異常往往會對造血產生不良結局。同時，VEGF內分泌途徑影響造血干細胞存活的研究提示我們，VEGF發揮作用既有內部途徑，又有外部途徑，體現了VEGF及其信號通路調控細胞增殖分化功能的廣泛性與復雜性。從多個角度思考VEGF信號對細胞的影響將是我們研究與之相關腫瘤性疾病發生的重要出發點，并為治療這些疾病帶來新的靶點和更有效的方式。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突