沃金黑牛GPR41基因多態性及其與不同階段生長性狀的相關性分析

劉 宇，肖 成，金海國，楊少瀅，繆立生，沈宏旭，曹 陽*

(1.吉林省農業科學院，長春 130000；2.農業農村部肉牛遺傳育種重點實驗室，長春 130000；3.延邊大學農學院，吉林 延吉 133000；4.吉林農業大學動物科學技術學院，長春 130000)

生長性狀是重要的數量性狀，能夠直接反映動物某一特定階段的生長發育情況和品種改良效果[1]，通常被用作研究本品種外貌特征和生產性能[2]，是衡量畜禽生產性能和經濟效益的重要指標[3]。孤兒型G蛋白偶聯受體(G protein coupled receptor 41，GPR41)，又稱FFAR3，位于牛18號染色體，共編碼326個氨基酸，已經被鑒定為SCFAs(短鏈脂肪酸)受體，主要參與SCFAs依賴性能量調節，在維持能量穩態中起不可替代作用。敲除GPR41將導致小鼠的體重和脂肪重量顯著降低[4-5]。LUU等[6]研究發現，GPR41能夠通過調節Th17/Treg平衡，有效治療潰瘍性結腸炎并緩解炎癥反應。嚴康[7-9]等研究證實奶牛瘤胃上皮細胞中上調的GPR41可介導瘤胃上皮保護性免疫反應。最近的一項研究表明,GPR41能夠將乳腺癌細胞表型從侵入性向非侵入性轉變[10]。TANG等[11]認為GPR41可能是一種有效預防和治療T1D的潛在靶點，調節胰島素的分泌。

沃金黑牛適應性強、肉質細嫩、風味突出，特別是肌內脂肪含量較高，具備生產高檔雪花牛肉的潛力。為了更好地優化沃金黑牛核心群體，本研究擬篩選影響沃金黑牛生長性狀的分子標記，利用分子育種的方法結合常規育種手段，對其進行優選。分子育種的關鍵是功能基因的選擇。目前，在關于牛GPR41基因的研究，主要集中在牛乳腺上皮細胞乳脂合成、牛瘤胃上皮細胞免疫反應和牛胃腸道發育等方面[12-14]，鮮有關于牛GPR41基因在生長發育方面的研究。因此，本研究通過檢測不同月齡沃金黑牛(去勢公牛)中GPR41基因的遺傳多態性，比較不同月齡階段中的群體間基因多態性差異，在分子水平上探討其與生長性狀是否存在關聯，挖掘與沃金黑牛生長性狀顯著相關的遺傳標記，以期促進基因標記輔助育種的應用，提高早期選擇和選育的準確性，加快沃金黑牛種質資源的開發與利用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

隨機挑選健康狀況良好的12月齡(35頭)、18月齡(28頭)沃金黑牛去勢公牛為試驗牛，飼養管理條件一致。

1.2 主要試劑與儀器

DNA試劑盒購自Axygen公司；超微量分光光度計Quawell-Q5000購自北京鼎盛生物技術有限責任公司；PCR儀T100購自上海伯樂生命醫學產品有限公司；2×ES Taq Master Mix 購自CWBIO公司。

1.3 方法

1.3.1 沃金黑牛性能測定 參照《NY/T 2660—

2014肉牛生產性能測定技術規范》認定的操作方法對沃金黑牛(去勢公牛)進行生長性狀測定。測定指標包括不同階段下的體重、體高、十字部高、體斜長、胸圍、腹圍、管圍，以及背膘厚、眼肌面積的超聲波測定指標。

1.3.2 沃金黑?；蚪MDNA的提取 利用DNA試劑盒提取沃金黑牛(去勢公牛)血液基因組DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書；利用Quawell-Q5000超微量分光光度計檢測提取的DNA濃度及純度；利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品完整度。

1.3.3 引物設計與合成 試驗所用的GPR41基因外顯子2的擴增引物序列參照同類研究[15]，委托金唯智生物科技有限公司合成，引物信息見表1。

表1 沃金黑牛GPR41基因擴增引物序列

1.3.4 普通PCR擴增 以提取的沃金黑牛(去勢公牛)血液DNA為模板，對GPR41基因第二外顯子進行PCR擴增。PCR反應條件為：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s；51.2 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，從第二步開始共32個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴增體系為20 μL：2×ES Taq Master Mix 10 μL，DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。

1.3.5GPR41基因多態性檢測 利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的PCR產物，將PCR產物送出(金唯智生物科技有限公司)進行Sanger測序；利用DNAMAN軟件分析測序結果，利用Chromas軟件分析測序結果峰圖，根據顯示的核苷酸序列和圖譜尋找SNP位點。與公布序列比對，分別定義純合基因型和雜合基因型；利用Haploview軟件對GPR41基因SNPs位點進行單倍型分析。

1.3.6 沃金黑牛群體遺傳結構分析 根據Sanger測序結果，計算基因頻率、基因型頻率。利用“牛等家養動物群體遺傳分析工具V1.0”評價沃金黑牛(去勢公牛)群體遺傳結構，進行Hardy-Weinberg卡方適合性檢驗，并計算遺傳雜合度(He)、遺傳純合度(Ho)、多態信息含量(PIC)和有效等位基因數(Ne)。

1.3.7 數據統計分析 采用SPSS 19.0軟件one-way ANOVA程序對GPR41基因不同基因型或單倍型的生長性狀進行統計分析，試驗數據以平均值±標準差表示，以P<0.05為差異顯著的判斷標準，以P<0.01為差異極顯著的判斷標準。

2 結果與分析

2.1 沃金黑牛GPR41基因的PCR擴增

對GPR41基因第二外顯子進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的條帶與預期片段大小相一致且特異性良好。

2.2 沃金黑牛GPR41基因多態性檢測

利用DNAMAN軟件對沃金黑牛(去勢公牛)GPR41基因第二外顯子的測序結果進行核苷酸序列比對，在編碼區Chr18:46058902 bp處和Chr18:46058908 bp處發現了G/T突變(S1位點)和C/T突變(S2位點)，但氨基酸序列均未發生改變。利用Chromas軟件依次比對SNP測序結果，發現GPR41基因在S1位點存在GT、TT和GG 3種基因型，S2位點存在CT、TT和CC 3種基因型(圖1和圖2)。

圖1 GPR41基因第二外顯子S1位點核苷酸序列對比結果

圖2 GPR41基因第二外顯子S2位點核苷酸序列對比結果

2.3 沃金黑牛GPR41基因群體遺傳結構分析

由表2可知GPR41基因-S1位點GT、TT和GG基因型頻率分別為50.79%、19.05%、30.16%，GT型個體數最多；G、T等位基因頻率分別為55.56%和44.44%，G為優勢基因。GPR41基因-S2位點CT、TT和CC基因型頻率分別為52.38%、30.16%、17.46%，CT型個體數最多；C、T等位基因頻率分別為43.65%和56.35%，T為優勢基因。適合性卡方檢驗表明，S1和S2位點的基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表2 沃金黑牛GPR41 SNP位點的基因型頻率和基因頻率

由表3可知，GPR41基因S1、S2位點的遺傳純合度(Ho)均高于遺傳雜合度(He)，說明其在沃金黑牛(去勢公牛)群體中的變異較??；多態信息含量分別為0.371 9和0.371 0(0.25

表3 沃金黑牛GPR41基因SNP位點的遺傳變異參數

2.4 單倍型分析

對檢測到的2個SNPs位點進行連鎖不平衡分析，發現S1、S2間D’=1、r2=1；S1和S2位點處于完全連鎖不平衡狀態，剔除頻率<0.01的單個單倍型，最終得到2種有效單倍型：H1(GT)和H2(TC)，頻率分別為0.563、0.437；群體內可形成3種具有統計意義的有效單倍型組合：H1H1(GG/TT)、H1H2(GT/TC)和H2H2(TT/CC)。

2.5 GPR41基因SNPs位點與沃金黑牛生長性狀的相關性分析

S1、S2位點與12、18月齡沃金黑牛(去勢公牛)生長性狀的關聯分析結果見表4。由表4可知，沃金黑牛(去勢公牛)S1位點：TT基因型12月齡體斜長、18月齡背膘厚分別顯著高于GG和GT基因型(P<0.05)，除腹圍外，TT、GT基因型12月齡生長性狀均高于GG基因型(P>0.05)，除背膘厚與眼肌面積外，GT基因型18月齡生長性狀均高于TT基因型(P>0.05)；沃金黑牛(去勢公牛)S2位點：CC基因型12月齡體斜長、18月齡背膘厚分別顯著高于TT和CT基因型(P<0.05)，除腹圍外，CT、CC基因型12月齡生長性狀均高于TT基因型(P>0.05)，除體斜長、背膘厚與眼肌面積外，CT基因型18月齡生長性狀均高于TT基因型(P>0.05)。

表4 GPR41基因SNPs位點不同基因型與沃金黑牛生長性狀的關聯分析

2.6 GPR41基因SNPs位點單倍型與沃金黑牛生長性狀的相關性分析

對3種有效單倍型組合個體對應的性狀進行差異顯著性檢驗，結果見表5。由表5可知，沃金黑牛(去勢公牛)H2H2單倍型的12月齡體斜長顯著高于H1H1單倍型(P<0.05)，沃金黑牛(去勢公牛)H2H2單倍型的18月齡背膘厚顯著高于H1H2單倍型(P<0.05)。除體高、十字部高和背膘厚外，H2H2單倍型12月齡各生長性狀均高于H1H1和H1H2單倍型組合(P>0.05)。除十字部高、胸圍和眼肌面積外，H2H2單倍型18月齡各生長性狀均高于H1H1和H1H2單倍型組合(P>0.05)。

表5 GPR41基因單倍型與沃金黑牛生長性狀的關聯分析

3 討 論

目前GPR41基因的研究主要集中在凋亡[16]、神經元受體調節[17]、上皮細胞免疫調節[18]、炎癥性腸病[19]、能量調節[20]等方面。ZHOU等[16]研究發現，GPR41-Gβγ-P13K/Akt通路的激活，能夠有效減弱發生大腦中動脈栓塞后引起的神經元凋亡。THORBURN等[21]研究證實，短鏈脂肪酸SCFAs通過細胞表面G蛋白偶聯受體-GPR41發出信號，激活抗炎信號級聯反應，增強腸道免疫屏障功能。張明等[22]研究發現GPR41是研究腸道和T1D關系的重要媒介物。Tolhurst等人[23]研究證實，GPR41 mRNA不僅在小鼠腸道L細胞中表達，且間接促進GLP-1和PYY等促胰島素激素的釋放。XIONG等[24]研究發現,瘦素的分泌因外源性GPR41過表達而增加，因siRNA介導的GPR41的敲低而減少，GPR41的激活能夠促進瘦素的釋放[25]。

科學的評價群體遺傳結構能夠為沃金黑牛(去勢公牛)優質資源群體的遺傳評價和保護利用提供參考依據。本試驗在沃金黑牛GPR41基因外顯子2處檢測到G/T和C/T突變，且純合度均高于雜合度，多態信息含量均表現為中度多態水平，說明GPR41基因的突變位點在沃金黑牛群體中遺傳均勻性較高，作為遺傳標記能夠提供較為可靠的遺傳信息。利用差異顯著性檢驗分析GPR41基因多態性與沃金黑牛各生長階段生長性狀的連鎖關系，有利于從根本上揭示沃金黑牛生長發育規律，提高群體選育。本試驗發現，GPR41基因S1、S2位點多態性與12月齡體斜長、18月齡背膘厚之間存在顯著相關，說明TT和CC可能是影響沃金黑牛生長性狀的潛在關鍵基因型。上述結果與在黃牛群體[26]和牦牛群體[15]中發現的GPR41基因多態位點與生長性狀關聯性研究結果相似。此外，本試驗發現在沃金黑牛不同生長階段，S1、S2位點各基因型與各生長性狀的相關性并不完全一致，一方面原因可能是樣本數量導致的樣本統計量差異，另一方面說明沃金黑牛在不同生長階段GPR41基因的轉錄表達機制可能存在差異，需進一步深入研究。

生長性狀受多個SNP位點或微效基因間的相互作用而共同調控，連鎖不平衡分析可以有效檢驗SNPs互作關系，單倍型分析可以準確研究目標性狀的關聯性[27]。對沃金黑牛(去勢公牛)群體GPR41基因SNPs位點進行連鎖不平衡及單倍型分析，有利于進一步揭示沃金黑牛表型性狀的遺傳信息。本研究中沃金黑牛GPR41基因S1、S2位點處于完全連鎖不平衡狀態，說明S1、S2位點并非處于彼此獨立的狀態，且趨于連鎖遺傳。本研究中沃金黑牛單倍型組合關聯分析結果與單個SNP關聯分析結果一致，其中S1位點的TT基因型、S2位點的CC基因型、單倍型組合H2H2均與沃金黑牛12月齡體斜長、18月齡背膘厚呈顯著相關,進一步驗證了S1和S2位點的連鎖關系。

上述結果說明，本研究檢測到的遺傳標記在沃金黑牛品種選育過程中的可行性與穩定性，初步驗證GPR41基因有望作為沃金黑牛生長性狀的優良候選基因，可在各生長階段育種工作中考慮增加GPR41基因的育種強度，從而更好地發揮沃金黑牛種質資源優勢。

4 結 論

沃金黑牛(去勢公牛)GPR41基因外顯子2在S1、S2位點存在遺傳多態性，且與沃金黑牛不同生長階段的體斜長與背膘厚顯著相關。單倍型組合H2H2與沃金黑牛不同生長階段的體斜長與背膘厚呈顯著相關，可用于沃金黑牛主要生長性狀的基因標記參考、穩定與優化。但GPR41基因能否作為沃金黑牛不同生階段生長性狀的分子標記位點，以及對體重等性狀的調控機制還需進一步深入研究。