數字PCR及實時熒光定量PCR技術在新冠核酸檢測中的應用

許婷 龔建江

【摘要】目的：探究新冠核酸采用數字PCR與實時熒光定量的PCR技術的檢測效果。方法：對本院2020年6月-2020年8月3例新冠肺炎（COVID-19）患者20份標本進行核算檢測研究，分別采用數字PCR與實時熒光定量PCR技術對N基因與ORF1ab基因進行檢測。結果：實時熒光定量PCR檢測結果：N基因均呈陽性;有14例ORF1ab基因呈陽性、6例呈陰性，提示N基因檢測呈單陽。以兩種基因Ct值分別為30.38、30.80（P=0.973）。數字PCR檢測結果：N基因與ORF1ab基因平均濃度為943016 copies/m L、1143730 copies/m L（P=0.553）;但采用實時熒光定量PCR檢測的2份樣本數字中，通過數字PCR可檢出。結論：本文研究的兩種檢測方法在COVID-19患者中具有較高的一致性，其數字PCR準確度更高，是實時熒光定量的PCR檢測的有效補充。

【關鍵詞】COVID-19;核酸;數字PCR;實時熒光定量PCR技術

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）主要是因新型冠狀病毒感染所致，咳嗽、發熱、呼吸困難及外周白細胞記數低下或正常和淋巴計數低下等臨床典型癥狀，感染率較高，尤其是今年出現病毒變異傳播速度更快，嚴重威脅患者生命安全。臨床主要采用新型冠狀病毒的核酸檢測，實時熒光定量PCR檢測時間短、靈敏度高，但隨著檢測樣本濃度降低，極易出現假陰性或弱陽性。數字PCR是一種新型核算定量檢測技術，可確保擴增體系的有效分配，得到精確濃度。本文深入分析新冠核酸采用數字PCR與實時熒光定量的PCR技術的檢測效果，現報道如下。

1 資料與方法

一般資料

對本院2020年6月-2020年8月3例新冠肺炎（COVID-19）患者20份標本進行核算檢測研究，尿液、糞便、血液標本分別為6、7、7份，男2例，女1例;年齡32-70歲，平均（51.15±10.21）歲。

方法

實時熒光定量PCR檢測：采用QIAcuity? One數字PCR儀（QIAGEN公司）提取本研究患者200μL檢驗標本，根據試劑盒說明書完成檢驗。陽性判定：Ct值≤38。同時確保對N基因與ORF1ab基因陽性Ct值為等值（25.62），并進行判讀。數字PCR檢測：采用Lightcycler 480 II實時熒光定量PCR儀（Roche公司），根據試劑盒說明實施檢測。標本濃度=反應體系濃度（copies/μL）×40×1000/12。

統計學方法

采用SPSS23.0計算，利用SPSS23.0軟件對數據進行配對t檢驗和線性回歸分析，若P<0.05，則兩組數據有差異。

2 結果

實時熒光定量PCR檢測結果：檢測發現，N基因均呈陽性;有14份ORF1ab基因呈陽性、6份呈陰性，提示N基因檢測呈單陽。兩種基因Ct值分別為30.38、30.80（P=0.973）。但ORF1ab基因Ct值大于32的7份樣本中，N基因Ct值更?。≒<0.001）。

數字PCR檢測結果：檢測發現，N基因與ORF1ab基因平均濃度為943016 copies/m L、1143730 copies/m L（P=0.553）;但采用實時熒光定量PCR檢測的2份樣本數字中，通過數字PCR可檢出。

3 討論

目前，實時熒光定量PCR是檢驗COVID-19的重要技術，但對技術要求較高，且試劑不同，檢測靈敏性也有較大區別?；颊咴诎l病初期，病毒濃度呈降低趨勢，極易出現假陰性。數字PCR主要采用了微流體技術，敏感性相對較高，檢測范圍較廣。本研究發現，采用實時熒光定量PCR檢測時，若ORF1ab基因Ct>32，且濃度較低的樣本，ORF1ab基因較N基因Ct值大，可能是與N基因含量相對較高相關。同時，實時熒光定量PCR 2份樣本N基因Ct值分別為37.57、37.92，與陽性判斷值較為接近，ORF1ab基因為陰性。表明若病毒載量較低時，采用實時熒光定量PCR檢測技術很難檢測。本研究中采用的兩種檢測方法中，數字PCR的N基因、ORF1ab基因濃度值與實時熒光定量PCR檢測的2個基因Ct值密切相關，提示兩種檢測方法具有較高的一致性，其中數字PCR方法檢測有更為準確的N基因、ORF1ab基因濃度值，可見在低拷貝數SARS-Co V-2核酸檢測時，數字PCR價值更高。

綜上所述，研究發現數字PCR方法檢測價值更高，可作為實時熒光定量PCR檢測的有效補充，提高敏感性，減少假陰性。對于初期感染患者，臨床治療后可采用數字PCR檢測，判定結果有較高的準確度。

參考文獻：

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