液相色譜串聯質譜在多囊卵巢綜合征診療中的應用

楊覲瑜

多囊卵巢綜合癥（PCOS）是在育齡女性中普遍出現的以生殖系統發育異常，以及內分泌與新陳代謝功能失調為特點的臨床綜合征，通?；疾〉呐砸部捎捎跓o法實現正常排卵而發生月經發育異常，更嚴重的時候甚至會喪失生育能力或發生復發性流產;在此病的影響下又因內分泌與新陳代謝失調，直接導致患者遠期新陳代謝紊亂，對患者的身體健康與生命安全帶來損害?；谠摷膊∫讓е聝确置诩按x紊亂，而高雄激素血癥是診斷該病的主要依據，為此我們認為利用液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）可精準檢測血液中的雄激素水平，將對PCOS診斷有較好的應用價值。

1液相色譜串聯質譜

質譜自1897年問世以來，就是一部多學科的交叉科學進步史，將近有十幾項諾貝爾獎包括物理獎以及化學獎在內，頒發給了與質譜技術有關的科學研究和應用，是當代高精尖技術平臺之一。目前，液相分離色譜-質譜聯用制備工藝方法（LC-MS/MS）已應用于醫療、環境、食物、化學等多個行業;質譜儀研究是指將物質轉換為帶電粒子，并按照各種物質的質荷比（m/z），把各種待測成分轉換到不同的質量分析器來完成樣品研究，目前的質量分析器一般包括如下幾類：四級桿質量分析器、離子阱質量分析器及飛行時間質量分析器等。在醫療檢驗領域，由于人體血液或生物樣品組成比較復雜，前處理需要純化和隔離后進行精準的檢測，質譜儀擁有比液相色譜更有效的隔離速率和分離度，具有高靈敏度和高特異性特點，且一針進樣即可測得多靶標值，目前已作為臨床應用檢驗領域中最有前瞻性和創新性的技術手段之一，在臨床應用檢測和疾病診斷方面都具有較好的應用價值，也因此高效液相色譜-質譜聯用技術代表了當今的精確醫學中的精準檢測，可以進行多重解析物的同時檢測，因此對于健康評價和疾病診斷方面都有著重要意義。

LC-MS/MS分析的臨床應用主要在以下幾方面：1.全譜氨基酸與全譜維生素的測定方法：因為，全譜氨基酸與全譜維生素在人類之中都處在一個動態平衡點，而一旦這種均衡點被打破，便會引起身體的多種疾病變化。而維生素與氨基酸則在人類中包括了細胞免疫、神經系統、激素生成、營養物質新陳代謝與能源新陳代謝等許多環節構成。所以，其測定方法對保健評估與病癥判斷均更具意義。時正媛等人采用UPLC-MS/M方法，確定了人類血清中13種氨基酸含量測定方法的新方法，將新鮮血清樣本先通過蛋白沉淀前的處理方法，提取上清液后再利用UPLC-MS/MS方法進行分析，分析方法時間短、特殊性強、靈敏度高，為全譜氨基酸檢測技術創造了試驗基礎。2.同型半胱氨酸檢測：高同形半胱氨酸（HCY）是引起心腦血管病變的獨立風險原因之一。Mccully首先給出了高同型半胱氨酸血癥可能導致冠狀動脈粥樣硬化疾病的假說。該假說認為HCY能引起毛細血管內皮系統的損傷，從而刺激了血管平滑肌細胞的生長，對低密度脂蛋白的抗氧化形成產生負面影響，同時提高血小板功能，從而促使血栓的生成。所以，檢測HCY對心腦血管疾病的有效防治和早期治療有著重要意義。3.類固醇激素檢查：類固醇激素是一種弱極化的小分子物質，一般由腎上腺質、胎盤和生殖腺組成，一般包括雄激素、雌激素、孕激素、糖皮質激素以及鹽皮質激素等，而類固醇激素的變化也可以作為對內分泌病變等診斷的依據所在，均會導致機體內有關激素水平的變化，如原發性醛固酮增生癥、先天性腎上腺皮質增生、庫欣綜合征和高雄血癥等。所以，對人體類固醇激素技術水平的檢測，才能成為疾病診斷的重要基礎。高潔等人利用固相含量提取法技術，結合了UPLC-MS/MS，成功建立了五十二種類固醇激素的測定方法，使用電噴霧正/負分子多反應檢測模型（MRM），靈敏度較高，基本能夠測量在pg級以下，為利用質譜分析法技術確定類固醇激素濃度的臨床提供可信證據，打下了基礎。4.膽汁酸譜測定：膽汁酸是關鍵的信息分子，在調控類脂、葡萄糖刺激和人體代謝方面起著主要功能。在肝膽疾病中，由于肝臟合成、代謝和清除以及胃腸消化吸收上的障礙，會影響膽汁酸在各個部位中的含量和分配。而膽汁酸品種也很多，因為其側鏈的構造、立體化學性質和氫氧基的數量與位置等差異，表現出多樣化甚至相反的生化和生理特性。非乙醇性脂肪性肝臟疾病是一類慢性的發生性肝臟疾病，涉及各種肝損傷，一般是脂類改性、非乙醇性脂性肝炎、纖維化和肝變硬。在非乙醇性脂肪性肝臟疾病中，肝功能膽汁酸代謝和轉運蛋白的變化或許會變化最重要的膽汁酸類型，進而直接影響餐后膽汁酸的依賴性信息傳遞，和調控肝炎癥級聯反應速度。肝細胞癌為最常見的原發性高血壓肝癌類型，占所有該類惡性腫瘤的80%～90%。研究表明，鵝去氧膽酸、去氧膽酸、石膽酸等膽汁酸成分，能對肝腎中星形細胞（HSCs）內NLRP3炎性細胞小體的活力產生雙向調控，進而直接影響肝細胞癌生成。膽汁酸譜檢測適合慢性肝病、病毒性肝炎、肝硬化、膽囊炎、胰腺炎、肝癌、肝膽胰外科手術患者等。

2多囊卵巢綜合征

多囊卵巢綜合征（PCOS）為育齡女人中較普遍的，以月經周期失調、排卵障礙、內分泌和代謝紊亂并伴發多囊卵巢（PCO）為主要癥狀的臨床綜合征，于1935年由Stein和Leventhal最早報告故也簡稱為Stein—Leventhal綜合癥，據國外報告在育齡婦女中的發生率僅為5%-10%，據中國報告則為百分之五點六;高發年齡段約為20～35歲;目前該病的原因和發生機理尚不清楚;但與基因和環境因素有關，并包括神經系統內分泌和免疫的復雜調節。家系分析結果顯示，雖然PCOS呈常染色體遺傳或x染色體連鎖顯性遺傳，但并不全部遵循孟德爾的遺傳規則。PCO S也是一種基因組病，目前的侯選物基因研究對象還有牛胰島素副作用有關基因組、高雄激素有關基因組和慢性炎癥因子有關基因等。同時，環境因素也參與了PCO S的形成、進展。尤其是在宮內高雄激素的過多環境、環境內分泌影響物如雙酚A、持久性的有機污染如多溴聯苯（PCBs）、抗癲癇藥、營養過剩和不良生活方式等都可以提高PCOS發病的危險性。在美國，與PCOS相關的醫療費用每年預估為11.6億美元。

PCOS臨床是一種復雜性多樣的、多系統的慢性內分泌機能阻礙，如經期反常、多毛、痤瘡以及伴隨肥大癥、高脂血癥、過多雄活性激素化等的各類癥狀，囊狀卵泡、胰島素抵抗、不孕癥和流產等，但大部分患者都僅明顯體現其中一些，臨床應用異質化也是目前缺乏統一治療規范的主要因素。對于PCOS疾病的檢查，主要通過臨床表現、超聲影像以及內分泌特征來診斷。目前，PCOS最廣泛使用的三大診斷標準是鹿特丹標準、NIH標準，以及AES標準。

1990年的由美國國家衛生研究院（NIH）制定的NIH指標包括（1）高雄性素的藥物臨床治療和/或高雄激素血癥;（2）慢性無排卵;（3）排除了具有這些病變中的某些有關病變，如高泌乳素血癥和甲狀腺病變、先天性腎上腺皮質增生等。需注意的是，在該檢查標準中，卵巢為多囊樣的結構改變（PCO）并沒有被用作檢查的客觀準則，并且該規范也沒有對規范的每一項內容進行具體闡述。

2003年，由歐洲人生殖健康和胚胎發育學會（ESHRE）與美洲生殖醫學學會（ASRM）舉行的鹿特丹PCOS專項大會對NIH診斷規范做出了修改，并制訂了"PCOS鹿特丹診斷規范"。成為全世界最廣泛使用的規范，鹿特丹對PCOS的定義如下：（1）排卵過少或無排卵;（2）存在對較高水平雄性素的臨床治療和/或生物學危害;（3）超聲檢查到女性卵巢多囊樣的改變，女性卵巢容積≥10mL（女性卵巢容積=0.5×長×寬×厚），和/或同一條切面上口徑為2～9mm的卵泡數≥12個。在上述三條中最大的前二項條件得到滿足而排除了其他病變時，即可開展PCOS檢測。鹿特丹號標準在原NIH標準表型上增加了PCO這一技術指標，是對原標準的進一步延伸，并將使確診為PCOS的目標人群比重大幅度地增加。

2006年，美國雄激素水平過多學會（AES）所制定的AES規范，對PCOS的界定如下：高雄激素血癥的先決條件，有排卵過少/無排卵，并排除其他有這些癥狀的疾病。AES標準涵蓋的患者范圍比NIH標準更廣泛，但比鹿特丹標準要窄。

隨著科學研究的開展，有研究人員證實了東南亞種族和歐美人種之間在血清雄激素水平、臨床高雄性素水平表達、新陳代謝狀況等方面有著顯著的人種差別。2008年，衛生部門開始研究建立"多囊卵巢綜合征診斷標準"以形成更符合于我國人群的治療規范，2011年出臺基于有關文獻和面向我國人的循證醫學研究成果的《PCOS確診和防治技術專家合作共識》。該標準對PCOS的危害原因、癥狀等作出了定義，并標準了輔助檢查和實驗室檢查方法，是由衛生部門統一頒布的標準文本，廣泛應用于我國各個醫學行業，具備了權威性、實用性和重要的臨床指導意義。與國外規范不同，我國多囊卵巢綜合癥檢查規范第一次明確提出"疑似PCOS"這一定義。該規范認為，經期稀發、閉經及不規則子宮出血是檢查的必要要求。另外，如再符合下列二項中的條l項，也可能診斷為疑似PCOS?。海?）高于正常雄激素水平的臨床或血癥;（2）超聲波檢測結果顯示為PCO。在滿足以上的疑似PCOS確診要求以后還需要逐一排查任何可以導致高安特靈水平的病癥，以及導致排卵異常的病變方可明確診斷。

2018年，由中華醫師總會內分泌物細胞代謝素科醫學分部制定的《多囊卵巢綜合征治療內分泌物專業合作意見》中華醫學會婦產科專業學分會內分泌學組制定的《多囊卵巢綜合征國家治療指引》，均通過了2011年的有關PCOS的診斷規范。

高雄激素血癥在PCOS的病理過程中起著重要作用，被認為是PCOS最穩定和最重要的診斷組成部分。然而，哪種雄激素檢測來輔助診斷PCOS仍然存在一定爭議。臨床上，人們普遍地把血清中總睪酮增高程度視為高雄激素血癥的主要診斷標準，但是事實上只有游離睪酮和部分與白蛋白以非特異性或最低親和度結合的總睪酮，才是真正有生物效性的總睪酮。常規檢測血清中總睪酮水平的方法并不能確定為高雄激素血癥的最靈敏指標。理想狀況下，建議應用于新鮮的血清睪酮（T）、雄烯二酮（AD）、硫酸脫氫表雄酮（DHEAS）、或二氫睪酮（DHT）和17-羥孕酮（17-OHP）的水平來評估女性過度雄激素的起源和程度。北京市婦產醫院檢驗科根據曹正教授等人的研究，進行了液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）同時對睪酮（T）、雄烯二酮（AD）、硫酸脫氫表雄酮（DHEAS）、二氫睪酮（DHT）和17-羥孕激素（17-OHP）進行定量分析的方法。根據國際臨床與實驗室指導標準研究所（CLSI）指南EP28-A3C，采用非參數方法結果表明，部分PCOS患者僅出現非T雄激素增加，因而同時定量這四種雄激素在PCOS診斷中的潛在臨床效用很高。

患有PCOS的女性中，不僅卵巢分泌的雄激素增加，且高達50%的患者DHEAS水平也升高。在女性中，DHEAS幾乎都是由腎上腺分泌的，睪酮來自卵巢25%、腎上腺（25%）和其他雄激素的外周轉化。有研究比較了DHEAS/睪酮比率對PCOS患者代謝參數的影響，他們都指出，具有高DHEAS/睪酮比率的PCOS患者具有更有益的代謝特征，使用DHEAS/睪酮比率有利于評估PCOS患者的代謝風險。

對PCOS的進一步檢查還需要排查其他有關病變，如高泌乳素血癥和副甲狀腺病變、腎上腺皮質增生等。二十一羥化酶缺乏非典型腎上腺增生?。∟C-CAH）是一個很常見的常染色體隱性遺傳綜合征，NC-CAH的主要臨床特征為多毛癥、排卵性和月經功能障礙，另外還有胰島素抵抗和多囊卵巢形態。僅基于臨床表現，很難區分NC-CAH與PCOS。在一篇回顧性比較PCOS和NC-CAH的文章中，平均41.87%的NCAH患者和25%的PCOS患者顯示血清17-OHP水平升高，這是區分這兩種綜合征推薦的篩查指標。相比之下，T和DHEAS等常見的雄激素在NC-CAH中也有所升高，但是在區分NC-CAH和PCOS方沒有太大意義?？紤]到測量17-OHP作為排除NC-CAH的廣泛接受度，因此臨床實驗室可以方便地將其納入用于PCOS診斷的雄激素中。

一項前瞻性研究表明，如果AD包含在雄激素檢測通道中，對PCOS的診斷率可增加約9%。DHT由T經5α還原酶作用形成，與雄激素受體結合的親和力更高，使DHT在其靶細胞中更活躍。所以，DHT是PCOS病人高雄激素血癥檢測與處理中的主要靶向雄激素之一，這也表明T+DHT檢測在PCOS鑒別方面優于任何單一雄激素。由此可見，在PCOS診斷過程中，T、AD、DHEAS和DHT的組合測定提供了更好的診斷能力，同時對17-OHP的測定還可以排除NC-CAH的影響。對雄激素的組合測定，用于評估女性過度雄激素的起源和程度，對臨床醫生進行PCOS診斷提供有力支持。

3質譜技術在多囊卵巢綜合征中的應用

因為類固醇激素分子結構相似，而大多數活性激素在人體內的濃度極微，且一般測定水平都在nmoL/L至pmoL/l數量級之間，故精密定量分析類固醇活性激素對儀器設備的敏感度和方法的精度都有很大的需求。目前，類固醇激素的檢測方式主要有化學免疫技術、液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）、氣相色譜-質譜聯用方式。二十世紀以前，傳統化學免疫法由于操作簡便快捷，在臨床上廣泛應用。但傳統的化學免疫法也具有許多弊端：一是對敏感度低下，在樣品含量很低時，就要求用很大的樣本量富集、提純;二是適用性較差，待測物的抗體易與和分子結構相同的內源性化合物以及代謝產物形成交叉反應，從而形成假陽性結果;三是分析效能低下，一般人一次只檢測一種化學物質，就無法同時完成幾種激素的定性與定量分析。所以，化學免疫法已逐步被生物色譜法所取代。氣相色譜-質譜聯用技術敏感度較高，但通常要求苛細的衍生化過程和較長的分析時限（通?！?0min），而且目前沒有一個適合于各種類固醇激素的衍生化試劑。而LC-MS/MS則減少了傳統氣相色譜法中苛細的衍生化過程，而且特異性較強，可以很好地消除對基質中類似結構化合物的影響，是各種類固醇激素中目前最安全的測定方式。另外，對LC-MS/MS的敏感度也最高，可以達到臨床實驗室中大多數類固醇激素的測試條件，并且通量高，可以一次檢測類固醇激素整條代謝通路，提供了更加豐富的診斷依據。值得注意的是，2013年美國內分泌學會指出：對于具有高影響力的臨床研究，類固醇免疫分析時代正逐漸接近尾聲。自2015年1月1日起，投稿至臨床內分泌與代謝雜志的性激素數據必須來源于質譜法檢測。預計基于質譜法檢測的要求未來將擴展到腎上腺類固醇激素和維生素D。

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